谭富耀,盛赵越,胡 婷,王蔚新,占剑峰,李士明,吴 鹏

(黄冈师范学院生物与农业资源学院,经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,大别山特色资源开发湖北省协同创新中心,湖北黄冈 438000)

福白菊是产于以福田河镇为中心的湖北省麻城市北部山区的白菊花,因以麻城市福田河镇为主产区而称之为麻城福白菊,其朵大肥厚、味甘醇美、气清香,具有养肝明目、解毒消肿、散风清热等功效[1],是最适宜人类饮用的保健类菊花。福白菊虽不如杭白菊和贡菊那样为人熟知,却有不同于其他品种菊花的种质资源和优良品质,富含黄酮和绿原酸,是药食兼用型中药材[2-3]。

黄酮类化合物又称生物类黄酮,具有抗菌、消炎、降低血压、抗肿瘤、降压及调节免疫功能等多种功效[4-5],在多个领域具有广泛的应用前景。麻城福白菊中总黄酮含量为6.17%～8.19%,远高于药典标准。目前,对菊花总黄酮提取方法的研究已有一些报道,比如水提法、微波辅助提取法、酶解法及回流法等。宋德海等[6]采用回流法对野菊花总黄酮的提取进行了研究,陈婷[7]通过正交试验优化菊花总黄酮的提取条件,崔建强等[8]利用响应面法优化了野菊花中总黄酮的微波辅助提取工艺,李金凤等[9]利用亚临界水提取法提取怀菊花中总黄酮并研究其抗氧化性。超声波提取黄酮是利用超声波不断震荡提取液,破坏细胞和细胞膜结构,增强细胞内物质通过细胞膜的透过率,有利于提取物的释放[10],相比其他提取方法,超声波辅助提取具有省时、高效、杂质少的优点。但响应面法优化麻城福白菊中总黄酮超声波辅助提取工艺及其抗氧化性研究未见文献报道。

因此,为了有效的开发及利用福白菊资源,充分提取其所含的总黄酮成分,实验以麻城福白菊为原材料,利用有机溶剂与超声波结合的方法,提取福白菊中总黄酮,运用单因素及响应面试验设计优化提取工艺,得到最优参数组合,并通过测定福白菊中总黄酮清除DPPH自由基的能力和总还原能力评价其抗氧化活性,旨在为麻城福白菊总黄酮的深加工提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麻城福白菊 湖北新奇益科技有限公司;无水乙醇(分析纯) 天津市天力化学试剂有限公司;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所;2,2-联苯基-1-苦基肼基 上海麦克林生化科技有限公司;氯化铁 酷尔化学科技(北京)有限公司;亚硝酸钠(分析纯)、氢氧化钠(粒状，分析纯)、硝酸铝、九水(分析纯)、铁氰化钾(分析纯)、L(+)-抗坏血酸(分析纯)、三氯乙酸(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

SHZ-DⅢ循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;标准检验筛 浙江上虞市五四纱筛厂制造;KQ-500DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;高速万能粉碎机、DK-98ⅡA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;723型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;H/T18MM台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 福白菊黄酮提取工艺流程 福白菊→粉碎→过筛→称重→超声波浸提→抽提过滤→定容→稀释→福白菊黄酮提取液[11]

福白菊的预处理:将福白菊烘干(60 ℃,1 h),粉碎后过80 目筛,再将其粉末烘干、密封备用。

超声波浸提:精确称取1 g福白菊粉放入锥形瓶中,根据料液比1∶25 g/mL加入70%乙醇作为提取剂,按照设定温度和超声波功率处理一定时间后,趁热减压抽滤,将滤液用70%乙醇定容至100 mL,得黄酮样品原液。

1.2.2 单因素实验 分别对超声功率、超声时间和超声温度进行单因素实验,确定各因素的适宜取值范围,从而选择响应面的设计试验的因素水平范围[12]。

1.2.2.1 超声波功率 取1 g福白菊粉,在提取料液比为1∶25 g/mL、超声时间为20 min、超声温度为60 ℃的条件下,分别探讨超声波功率为300、350、400、450、500 W对黄酮类化合物得率的影响。

1.2.2.2 超声时间 取1 g福白菊粉,在提取料液比为1∶25 g/mL,超声波功率为200 W,超声温度为60 ℃条件下分别探索超声时间为30、40、50、60、70 min对黄酮类化合物得率的影响。

1.2.2.3 超声温度 取1 g福白菊粉,在提取料液比为1∶25 g/mL,超声时间为20 min,超声波功率为200 W条件下探讨超声温度分别为30、40、50、60、70 ℃对黄酮类化合物得率的影响。

1.2.3 响应面试验 以单因素实验为基础,以超声时间(A)、超声波功率(B)、超声温度(C)为独立自变量,福白菊黄酮得率(Y)为响应值,利用Box-Behnken中心设计方法进行3因素3水平响应面试验设计[13],因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素及水平设计Table 1 Factors and levels in response test

1.2.4 黄酮得率的计算

1.2.4.1 最大吸收波长的选择 菊花中含有多种黄酮类化合物,其黄酮母核中含有的游离羟基,在适当的介质条件下能与金属铝离子形成络合物而显色,显色后于510 nm波长处有最大吸收峰值[14]。鉴于芦丁和黄酮类化合物的结构均以2-苯基色原酮为母核,吸光测试性质相似,故以芦丁作为测定福白菊黄酮含量的参比物,选取510 nm为测定波长,测定其吸光度并绘制标准曲线。

1.2.4.2 芦丁标准曲线的绘制 参考宋琳琳等[15]方法,精确称取0.0150 g芦丁参照物放置在50 mL容量瓶中。用体积分数为70%乙醇定容、摇匀后得到标准溶液。分别量取参照物溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中,加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL,摇匀后静置6 min,加入10%硝酸铝溶液0.3 mL,摇匀后静置6 min,加入4 mL体积分数为4%氢氧化钠溶液后再用30%乙醇定容,摇匀放置15 min,在510 nm处测定吸光度[16]。以吸光度A为纵坐标,芦丁浓度C为横坐标,绘制得回归方程曲线y=0.1547x+0.0059,决定系数R2为0.9992。

1.2.4.3 福白菊总黄酮得率计算 取1.5 mL黄酮样品原液,按标准曲线绘制方法制备待测样品溶液。在波长为510 nm处测定吸光度,计算福白菊中黄酮的得率。将测定所得的吸光值代入回归方程中计算黄酮质量浓度,再计算出黄酮的得率[17]。

式中:ω表示福白菊中总黄酮的得率,%;V表示提取液体积,mL;c表示由回归方程计算出的样液中总黄酮浓度,g·L-1;N表示稀释倍数;W表示菊花粉末质量,g;1000表示单位换算系数。

1.2.5 福白菊黄酮抗氧化活性探究

1.2.5.1 总还原能力 以抗坏血酸为对照,将黄酮提取液分别配制成浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L的待测样液。用蒸馏水做参比,先分别加入1 mL样液,再加入2.5 mL磷酸盐溶液和2.5 mL 1%铁氰化钾,放置于50 ℃水浴中反应20 min后加入10%三氯乙酸2.5 mL,3000 r/min离心10 min后取上清液2 mL放入另一管中,随后加入2 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混匀后室温反应10 min,在700 nm处测定吸光值,吸光度值越大,则证明总还原能力越强[18]。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率 以抗坏血酸为对照,将黄酮提取液分别配制成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的待测样液。将2 mL黄酮提取液与2 mL质量浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液混匀置于试管中,室温下在暗处静置30 min后,以无水乙醇作为参比,在517 nm处测定其吸光度Ax;同时以2 mL无水乙醇代替样品,与2 mL DPPH溶液混匀后在同一吸收波长处测定其吸光值A0;再取等浓度的样品与等体积无水乙醇混合,测定其本底吸光值AX0,并计算得DPPH自由基的清除率[19]。

式中:A0:2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇的混合溶液吸光度;AX:2 mL黄酮样品溶液与2 mL DPPH溶液的混合溶液吸光度;AX0:2 mL黄酮样品与2 mL无水乙醇等体积混合液的吸光度。

1.3 数据处理

所有试验均平行重复测定3次,利用Design Expert 8.0软件进行响应面试验设计和结果分析,采用Microsof Excel 2010及SPSS 25.0对单因素及抗氧化研究数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声波功率对得率的影响 由图1可得知,当超声波功率为300～400 W时,黄酮的得率逐渐升高,功率为400 W时,黄酮的得率最大,为6.31%;而超声波功率为400～500 W时,黄酮的得率又逐渐下降,可能是超声波能在物料内部产生振动,超声波功率较小对植物细胞和分子间的作用较小,超声波功率增大,空化效应更强烈,因此黄酮得率增大;但功率过大时致使黄酮结构遭到破坏,从而得率下降[20]。

图1 超声波功率对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield of flavonoids注:不同字母表示具有显著性差异(P<0.05);图2～图3同。

2.1.2 超声时间对得率的影响 如图2所示,在30～60 min内,黄酮类化合物的得率随超声时间的延长而增多。当超声时间在30～40 min之间时,得率相对稳定。当超声时间为40～60 min时,福白菊黄酮的得率显著提高。当超声时间为60 min时,黄酮得率达到最大,为6.36%,而当超声时间大于60 min时,得率开始迅速下降。说明在60 min左右时,福白菊粉末与乙醇充分接触,黄酮溶出充分,继续增加超声波处理时间,会导致黄酮分子结构被破坏,从而黄酮得率降低[21]。

图2 超声时间对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of flavonoids

2.1.3 超声温度对得率的影响 由图3可得知,超声温度的变化对黄酮得率影响效果明显,超声温度在30～60 ℃时,得率由5.18%增加至5.96%,在此阶段黄酮得率有显著的上升趋势。超声温度为60 ℃时,黄酮得率达最高,为5.96%。但当温度为70 ℃时,黄酮的得率又快速下降至5.18%。原因是温度过高,黄酮类化合物结构遭受到破坏[22],导致其有效活性成分和原料流失,同时杂质溶解度和溶剂损失成分增加。

图3 超声温度对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of flavonoids

2.2 超声波辅提福白菊黄酮工艺响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 以单因素实验选择的水平范围为基础,超声时间(A)、超声波功率(B)和超声温度(C)为影响因子,福白菊黄酮得率(Y)为响应值,采用Box-Behnken实验设计针对黄酮得率和三个因素进行响应面设计得到17组试验点[23]。实验设计和结果分析见表2。

表2 响应面试验设计及结果分析Table 2 Design and analysis results of response surface experiments

Y=6.85-0.099A+0.58B+0.050C-0.24AB-0.17AC-0.27BC-0.12A2-0.51B2-0.25C2。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0软件对响应面试验进行设计和结果分析(表2),并进行二次多元回归拟合,得回归方程模型[24-25]:

2.2.2 响应面分析 基于回归模型分析,通过各因素的相互作用,对福白菊黄酮得率进行响应面和等高线图分析[27],建立三维模型图。见图4～图6。

从图4、图5和图6可以直观地看出三个因素的交互作用对福白菊黄酮得率的相关影响,随着超声温度、超声时间以及超声波功率的梯度增加,黄酮得率呈先升高后下降的变化,因此在选用的数值范围间存在极值。响应曲面坡度越陡峭,说明响应值变化对相关因素的交互作用越敏感,反之则交互作用对响应值影响越小。图4和图6中响应面图坡度陡峭,表明其相关影响因子对黄酮得率的交互作用显著。而图5中的响应面曲线弧度较平滑,说明超声温度和超声时间的交互作用对黄酮得率的影响较小。由模型图的总体分析可以看出,随超声波功率的逐渐增加,黄酮得率变化更敏感,证明提取功率对黄酮得率的作用影响均大于超声时间和超声温度,这与方差分析结果吻合,证明响应面试验优化结果的合理可靠[28]。

图4 超声波功率与超声时间交互作用对福白菊黄酮得率的影响Fig.4 Effect of interaction between ultrasonic power and time on yield of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

图5 超声温度与超声时间交互作用对福白菊黄酮得率的影响Fig.5 Effect of interaction between ultrasonic temperature and time on yield of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

图6 超声温度与超声波功率交互作用对福白菊黄酮得率的影响Fig.6 Effect of interaction between ultrasonic temperature and power on yield of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

2.2.3 试验结果验证 利用软件Design Expert 8.0响应面模型进行分析,根据模型分析预测出福白菊黄酮的最大得率为7.16%,此时其最优工艺组为:超声时间50.00 min,超声波功率439.9 W,超声温度60.08 ℃。根据实际条件将最优工艺调整为:超声时间50 min,超声波功率440 W,超声温度60 ℃。按照此条件组做三次平行试验,实际测得平均黄酮得率为7.15%,与响应面设计分析的预测值基本吻合,相对误差为0.01%,证明该模型预测结果有效可靠。

2.3 福白菊黄酮抗氧化活性测定结果

2.3.1 总还原能力测定结果 福白菊黄酮及抗坏血酸的总还原能力测定结果见图7。

图7 福白菊黄酮的总还原能力Fig.7 Total antioxidant capacity of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium注:不同小写字母代表相同质量浓度差异显著,P<0.05;图8同。

由图7可知,福白菊总黄酮总还原能力与其质量浓度间呈正相关关系,当黄酮质量浓度在0.01～0.05 g/L的范围内,黄酮的总还原能力随其质量浓度的增大而增大。当福白菊黄酮质量浓度为0.05 g/L时,其总还原能力最高,即吸光度值最大,为0.341。与相同浓度的抗坏血酸相比,福白菊黄酮的总还原能力略低于抗坏血酸。

2.3.2 DPPH自由基清除能力测定结果 福白菊黄酮及抗坏血酸清除DPPH自由基能力测定结果见图8。

图8 福白菊黄酮DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate of flavonoids from Macheng Chrysanthemum morifolium

由图8可知,不同质量浓度的黄酮样品溶液的DPPH自由基清除能力不同,当黄酮溶液浓度在0.1～0.5 g/L范围内时,随着黄酮质量浓度的增大,其溶液对DPPH自由基的清除能力也逐步增加,但均小于90%。当黄酮溶液浓度为0.5 g/L时清除率为81.25%,达到最高。福白菊黄酮对DPPH自由基的半数清除浓度IC50值为0.191 g/L,抗坏血酸在0.1～0.5 g/L的浓度区间，其对DPPH自由基的清除能力远大于50%,说明在相同浓度下,黄酮溶液对DPPH自由基的清除能力弱于抗坏血酸。

3 结论

采用超声波辅助提取福白菊中的黄酮类化合物,并对其抗氧化活性进行探讨。在单因素试验的基础上,通过响应面试验设计得出最佳工艺参数组合为:超声波功率为440 W,超声温度为60 ℃,超声时间为50 min,黄酮得率为7.15%。抗氧化活性研究表明,当黄酮溶液浓度为0.05 g/L时,总还原能力最强,此时测得的吸光度值最大,为0.341;当黄酮溶液浓度为0.5 g/L时,其对DPPH自由基的清除率达到81.25%,对DPPH自由基的半数清除浓度IC50值为0.191 g/L,表明福白菊黄酮提取液具有较好的抗氧化活性,可以为福白菊黄酮类化合物的探索研究及进一步开发利用提供理论依据,也可提高麻城福白菊开发价值和经济效益。