胡翠 李巍 张婷 鲁慧 吴亚芳 钱华

苏州大学附属儿童医院皮肤科215025

长期慢性紫外线照射可诱导皮肤成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）合成、线粒体损伤、蛋白质氧化损伤和端粒缩短等，使皮肤加速衰老甚至出现癌变［1-2］。本研究小组前期发现，微小RNA（miRNA）-1246是紫外线照射诱导光老化中出现显著下调的miRNA之一［3］，其靶点基因丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14，又称p38）是MAPK 信号通路关键分子，与MMP 及胶原降解等细胞光老化机制具有密切关系。本研究通过建立长波紫外线（UVA）照射诱导的人皮肤原代成纤维细胞（HSF）的光老化模型，检测miR-1246和MAPK14 的表达，并用慢病毒转染上调miR-1246 的表达，观察其对细胞增殖和光老化的影响，探讨其内在的分子机制。

材料与方法

一、材料与仪器

DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；UVA 照射仪（上海希格玛公司）；Dispase酶、胶原酶（美国Sigma公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen 公司）；MAPK14 鼠单克隆抗体（美国Sigma 公司）；MMP-1 兔单克隆抗体（美国Abcam公司）；增强化学发光试剂（ECL）（美国Bethyl 公司）；山羊抗兔IgG抗体、山羊抗小鼠IgG抗体（上海碧云天生物技术研究所）；人源has-miR-1246 慢病毒表达载体、慢病毒转染试剂盒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），实时定量PCR 试剂盒、SYBR 荧光染料试剂（日本Takara 公司）；ABI7300 实时定量PCR 仪（美国ABI公司）。

二、HSF的分离和培养

HSF分离自本院泌尿外科收集的5例3 ～12岁健康儿童包皮环切术后皮肤标本。本研究通过苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准（批号：2020CS003），患儿监护人均签署知情同意书。

包皮标本用含1%青链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，清除皮下脂肪和血管后，将标本剪成宽为3 mm 的皮条，使用Dispase 酶在37 ℃消化3 ～4 h，分离表皮与真皮。……