韩晶，洪艳**，王琪，檀梦天

(1.贵州医科大学 组织胚胎学教研室，贵州 贵阳 550025； 2.河北工程大学附属医院 科教处，河北 邯郸 056038)

Ⅰ型糖尿病由于胰岛素分泌缺陷或(和)胰岛损伤可引起高血糖，目前的治疗手段为长期依赖药物或胰岛素替代治疗，但随着病程的发展及伴随的多种并发症，该病具有很高的致残及致死率。不同来源的干细胞以及胰岛前体细胞在体外经诱导剂处理后分化为胰岛素分泌细胞再移植的方法是Ⅰ型糖尿病最理想的治疗方式[1]，而人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells , hUMSCs)具有来源广泛、较低免疫原性、易于分离培养等优点，在组织工程和细胞治疗领域具有广阔的应用前景[2-5]。Notch信号通路是影响细胞命运的经典通路之一，在干细胞的诱导分化过程中主要调节细胞分化、增殖及凋亡等[6]。神经元素3(neurogenin-3，Ngn3)是一种螺旋状的转录因子，专一性表达于胰岛前体细胞[7]，Ngn3的缺失突变会导致新生儿糖尿病，并阻止胰岛β细胞从人类多能干细胞分化[8]。目前对诱导hUMSCs体外分化过程中Notch信号通路与Ngn3表达的关系报道较少，本研究采用分阶段联合诱导法(前10 d用含EGF的低糖培养基，后11 d用含激活素A和尼克酰胺的高糖培养基)诱导体外培养的hUMSCs向胰岛前体细胞分化，检测诱导后细胞中Notchl、胰岛前体细胞标记物Ngn3的变化，报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本 脐带来源于健康足月剖宫产手术，由贵州医科大学附属医院及贵阳市花溪区人民医院产科提供，家属知情同意。产妇经检查无艾滋病、乙型肝炎病毒、梅毒、螺旋体、支原体等传染病原体感染情况，血糖血压均在正常范围内。

1.1.2试剂与仪器 DMEM/F12培养基、青链霉素混合液(Solarbio公司，美国)，0.25% 胰蛋白酶(Hyclone公司，美国)，胎牛血清FBS(Gibco公司，澳大利亚)，γ分泌酶抑制剂(DAPT，亦瑞生物技术有限公司，上海)，鼠抗人CD105单克隆抗体，兔抗人CD34、CD45单克隆抗体(博士德公司，武汉)、兔抗人Ngn3(Abcam公司，美国)，兔抗人Notch1、兔抗人Pdx1单克隆抗体(Epitomics公司，美国)，兔抗人胰高血糖素(Glucagon，Watpa公司，新西兰)，单克隆抗体β-actin抗体(Abmart公司，美国)，内皮生长因子(EGF)、激活素A (Pepro Tech公司，美国)，尼克酰胺(Sigma公司，美国)，HRP标记山羊抗兔IgA(百奥莱博科技有限公司，北京)，倒置相差显微镜(C-SHG, Nikon公司，日本)，电子显微镜HITACHI7650(日立公司，日本)，Bio-Rad伯乐梯度PCR仪(伯乐Bio-rad公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1hUMSCs分离、培养及诱导 取健康足月剖宫产术后脐带，长度约为5～10 cm、直径约为1～2 cm，高压灭菌的PBS溶液内放置，4 ℃保存，4 h内使用；用PBS清洗干净后在超净工作台中剪成1～2 cm，剥离脐动脉，分离脐静脉内皮；分离组织、剪碎至1 mm3大小，加入含有20% FBS DMEM/F12培养基，浸泡1～2 min；使用眼科镊将其转移到T25培养瓶中成阵列分布，各组织块间间隔在5～6 mm，倒置放入37 ℃、50 mL/L CO2培养箱内，2 h后取出；加入含有20% FBS DMEM/F12培养基1 mL，继续培养，此后每隔1 d加入20% FBS DMEM/F12培养基1 mL，加至5 mL时停止。隔日观察，有长梭形细胞迁移出组织块时换液，传至第3～5代，采用分阶段联合诱导法诱导：前10 d采用低糖培养基(含10% FBS、5.5 mmol/L葡萄糖、20 μg/L EGF的DMEM/F12培养基)培养，每隔2 d换液；诱导培养至第11天时采用高糖培养基(含10% FBS、25 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L尼克酰胺、10 μg/L激活素A的DMEM/F12培养基)培养，每隔2 d换液，诱导培养至第21天。

1.2.2实验分组 单独培养的hUMSCs作为空白对照组，加入诱导因子后培养至第7天、第14天及第21天的hUMSCs分别作为诱导第7天组、第14天组及第21天组。另取P5代hUMSCs作为阻断组，按照上述分阶段联合诱导法诱导，全程在培养基中加入γ分泌酶抑制剂(用DMSO溶解，终浓度为5 μmol/L)，至第21天完成阻断诱导。

1.2.3hUMSCs鉴定 取P5代hUMSCs以1×104密度接种在载玻片上，接种后第3天观察并取贴壁较好的细胞爬片，PBS洗涤、4% 多聚甲醛固定、0.3% TritonX-100 破膜、3% 过氧化氢和山羊血清(1 ∶100)分别封闭20 min；按照试剂说明书，分别加一抗CD105、CD34、CD45(1 ∶100)，4 ℃湿盒孵育过夜；PBS洗涤3次，加免疫组化检测试剂(PV-6001/ PV-6002)；DAB显色，倒置相差显微镜下观察并采集图像。

1.2.4hUMSCs诱导的胰岛前体细胞鉴定 取诱导第21天组和空白对照组细胞，以1×104密度接种在载玻片上，采用免疫细胞化学技术，分别加入一抗Ngn3(1 ∶100)、Pdx1(1 ∶100)、Glucagon(1 ∶4 000)孵育，其余操作步骤与1.2.3相同，显色后在倒置相差显微镜下观察并采集图像。

1.2.5电镜观察诱导后胰岛前体细胞 取诱导第21天组细胞进行细胞计数(数量为2×104)，收集，冲洗，离心沉淀，预冷2.5% 戊二醛4 ℃固定24 h；1% 锇酸固定1 h；丙酮梯度脱水各15 min；Epon812渗透聚合包埋；修块、切片60 nm厚；轻醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，电子显微镜HITACHI7650观察并采集图像。

1.2.6Ngn3和Notch1的表达 取诱导hUMSCs过程中诱导各组和空白对照组细胞，以1×104密度接种在载玻片上，采用免疫细胞化学技术，分别加一抗Ngn3(1 ∶100)和Notch1(1 ∶400)，其余操作步骤与1.2.3相同，显色后在倒置相差显微镜下观察并采集图像。

1.2.7Ngn3、Notch1及GlucagonmRNA表达 分别取诱导第7天、第14天、第21天组hUMSCs，PBS洗涤3次后加入Trizol等试剂提取细胞总RNA，步骤参照试剂盒说明书；选取20 μL作为反转录的反应体系进行逆转录，应用上海生工公司提供的PCR引物，采用Bio-Rad伯乐梯度PCR仪进行荧光定量PCR，目的基因引物序列如表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8Ngn3、Notch1蛋白表达 收集P5代及在诱导第7天、第14天、第21天组、空白对照组及阻断组的hUMSCs，冰上裂解(裂解液PMSF ∶RIPA=1 ∶100)；收集细胞，离心后取上清，按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度；各组蛋白上清加入5× 蛋白上样缓冲液加热变性后加至SDS-PAGE凝胶中，经电泳、转膜、封闭液封闭后，分别用对应一抗Ngn3(1 ∶500)、Notch1(1 ∶1 000)、内参蛋白兔抗人β-actin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育过夜，转PVDF膜3次。加入HRP标记山羊抗兔IgA(1 ∶20 000)，室温孵育1.5 h，再次TBS-T洗膜3次；化学发光法检测蛋白表达，凝胶成像系统拍照，重复3次。

1.3 统计学处理

运用SPSS Statistics 20.0建立数据库，符合参数检验条件的数据，用均数、标准差进行统计描述，多组均数间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD法；不符合参数检验条件的数据变量变换后仍不符合，采用秩和检验；P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hUMSCs分离与培养

取健康足月剖宫产儿脐带(图1A)，剪碎后平铺于培养瓶底(图1B)，连续培养10 d后观察，原代hUMSCs从组织块中迁移出，贴壁生长(图1C)，消化传代至P5代，细胞生长稳定，呈长梭形，漩涡状生长(图1D)。

2.2 hUMSCs表面标记分子的鉴定

免疫细胞化学染色显示hUMSCs表达CD105，细胞的胞膜和胞质呈现棕黄色(图2A)； CD34、CD45呈阴性表达，细胞的胞膜和胞质无明显棕黄色(图2B、2C)；空白对照组细胞未着色(图2D)。

2.3 胰岛前体细胞的鉴定

诱导第21天组hUMSCs内Ngn3(图3A)、Pdx1(图3B)、Glucagon(图3C)免疫组化染色呈阳性，空白对照组未见着色(图3D)。透射电镜观察胰岛前体细胞，可见细胞核大，形状不规则，核内染色质较稀疏，未见核仁，胞质内含有许多染色深浅不一的分泌颗粒，细胞器丰富(图4A)；图4B中可见 hUMSCs细胞核大，核内染色质较稀疏，可见2个明显的核仁，核质比大，细胞内胞质量少，未见分泌颗粒，细胞器较少。

注：A为足月产儿脐带，B为组织块植入培养瓶，C为P0代细胞第10天，D为P5代细胞第3天。图1 分离与培养hUMSCsFig.1 Isolation and culture of hUMSCs

注：A为 CD105细胞，B为CD34细胞，C为 CD45细胞，D为空白对照。图2 hUMSCs表面标记分子鉴定(免疫细胞化学染色，×100)Fig.2 Identification of hUMSC surface markers (Immunohistochemical staining,×100)

注：A为Ngn3免疫阳性细胞，B为Pdx1免疫阳性细胞，C为Glucagon免疫阳性细胞，D为空白对照组。图3 胰岛前体细胞鉴定(免疫细胞化学染色，×100)Fig.3 Identification of islet progenitor cells(Immunohistochemical staining,×100)

注：A为胰岛前体细胞(×32 000)，B为hUMSCs(×48 000)，N为细胞核，G为分泌颗粒。图4 胰岛前体细胞透射电镜观察 Fig.4 Images of islet progenitor cells and hUMSCs under transmission electron microscope

2.4 hUMSCs向胰岛前体细胞诱导过程中的Notch1与Ngn3表达

诱导后可见hUMSCs呈多边形，胞体较宽大，核大，卵圆形，核仁明显。诱导第7天(图5A)、第14天(图5B)、第21天(图5C)Ngn3免疫阳性细胞胞质呈棕黄色，空白对照组着色浅淡(图5D)。Notch1表达如图6所示，Notch1免疫阳性细胞胞质呈棕黄色，第7天(图6A)、第14天(图6B)表达增多，着色逐渐深染，第21天(图6C)较第14天表达减少，空白对照组较各诱导组细胞着色浅(图6D)。

注：A、B、C分别为hUMSCs诱导第7、14及21天，D为空白对照组。图5 各组hUMSCs中Ngn3表达 (×100)Fig.5 The effect of induction on Ngn3 expression (×100)

2.5 Ngn3、Notch1及Glucagon mRNA表达

与对照组比较，第14天组Ngn3，第7、14及21天组的Notch1，第14及21天组GlucagonmRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；诱导过程中Ngn3表达量在第14天时达到峰值，第21天降低；Notch1表达在第7天时最高，随后下降；空白对照组表达量较低。诱导各组的Glucagon表达于第7天升高，第14天及第21天降低。见图7。

注：(1)与对照组比较，P<0.05。图7 各组hUMSCs中Ngn3、Notch1及Glucagon mRNA表达Fig.7 The effect of induction on the mRNA levels of Ngn3, Notch1 and Glucagon in each group

2.6 Ngn3与Notch1蛋白表达

Ngn3蛋白表达量随诱导时间延长而逐渐增高(P<0.01),第14天表达最高，第21天减少；Notch1蛋白表达量在第7天最高，之后随诱导时间延长而逐渐减少，第21天最少(图8)。阻断组Ngn3蛋白表达减少，与诱导第21天组比较均具有统计学意义(P<0.05)，诱导第21天组Notch1蛋白表达灰度值与阻断组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图9。

3 讨论

人类间充质干细胞是一类被广泛研究的成体干细胞，在再生医学中具有巨大潜力[9]。本实验选用hUCMSCs 作为种子细胞，细胞从脐带组织分离后培养，阳性表达间充质干细胞表面分子 CD105 , 阴性表达造血干细胞表面分子CD34 和CD45，符合间充质干细胞的一般特征。前期研究[10]和本实验利用分阶段联合诱导法诱导 hUCMSCs 向胰腺前体细胞分化，先在低糖环境作为基础培养，再经过高糖培养基中高糖刺激，有利于以Pdx1 阳性表达为特征的胰腺祖细胞向胰岛细胞分化[11-12]。Notch信号通路是影响干细胞增殖分化过程中细胞命运的关键通路之一。哺乳动物有4种Notch受体和5种Notch配体，其中Notch1受体表达相对稳定[13]。在正常发育的胰腺中，激活Notch信号可阻止胰腺前体细胞分化，分化完全的内分泌腺会失去对Notch信号的应答[7]。本实验结果提示，诱导hUMSCs分化至第7天有胰岛前体细胞出现，细胞表达高水平Glucagon，随诱导时间延长，Notch1受体表达减少，Glucagon水平下降；诱导至第21天时，电镜观察到胞体内出现分泌颗粒，以上变化提示胰岛前体细胞可能进一步分化各种胰岛内分泌细胞。研究表明，小鼠胰腺发育早期，Glucagon分泌细胞发育较早，并可能短暂分泌胰岛素，Glucagon分泌细胞与胰岛素分泌细胞的分化由相似的转录因子调控交替进行[14]。Notch信号通过下游基因抑制Ngn3表达，保持小鼠胰腺祖细胞数量，以后Notch信号以浓度依赖的方式发挥作用；Notch低表达导致Ngn3激活和内分泌分化，高水平Notch表达导致胰管细胞产生[15]。Notch信号通路早期活化抑制Ngn3表达，以阻止向胰岛前体细胞方向分化[16]。本实验结果也显示，诱导至第7天和第14天Notch1和Ngn3 mRNA水平变化呈相反，提示体外诱导培养人hUMSCs向胰岛前体细胞分化过程中，Notch1和Ngn3也存在上述调控机制。胰岛内所有内分泌细胞的前体细胞在早期均表达Ngn3，Ngn3基因及其转录调控网络活化表达后，启动胰腺内分泌细胞和导管细胞的转录程序，胰腺祖细胞分别向内分泌腺和外分泌腺方向分化[17]。小鼠胃旁路手术后观察到Notch1受抑制，Ngn3水平升高从而促进胰岛β细胞再生[18]。胰腺祖细胞Ngn3蛋白低水平表达是有内分泌分化倾向细胞的特征，也是启动内分泌细胞定向分化的关键[19]。但Ngn3蛋白水平的调控目前尚不清楚，有报道Ngn3蛋白多位点磷酸化可以调控胰腺内分泌分化，Ngn3蛋白去磷酸化可以促进B细胞的体外生成，这有助于解释在胰腺祖细胞向内分泌细胞转变过程中，Ngn3表达从高到低的转变[20]。

注：(1)与诱导期间各组比较，P<0.01；(2)与第7及第21天比较，P<0.01。图8 各组Ngn3、Notch1蛋白表达水平Fig.8 The effect of induction on the expression of Ngn3 and Notch1 in each group

注：(1)与诱导第21天组比较，P<0.05。图9 Western blot法检测诱导21天组与阻断组Ngn3、Notch1表达水平Fig.9 Western blot analysis of Ngn3 and Notch1on the 21st day groups of induction and inhibition

DAPT是人工合成的 γ分泌酶抑制剂，毒副作用较小，特异性强，可有效阻断胞内Notch受体酶切过程，使Notch无法激活，从而抑制Notch信号通路的活化过程，是目前公认的Notch信号通路阻断剂，常被用于研究Notch 信号通路[21-23]。Notch信号下调或抑制可促进胰岛内分泌细胞分化[24]。DAPT可通过减少Ngn3+/胰岛素-细胞防止糖尿病小鼠β细胞去分化[25]，Xl等[26]用DAPT阻断Notch 信号通路证实正常小鼠胚胎胰腺中Notch信号是Ngn3蛋白分子稳定的主要调控因子。关于Notch 信号通路被阻断后Ngn3变化的研究仍少见报道。本实验结果表明Notch信号通路抑制剂能引起Ngn3表达增多，推测Notch信号通路的持续活化可能抑制hUMSCs向胰岛前体细胞分化，但Notch1水平未见明显变化，可能由于Notch1是细胞表面的受体，未受到细胞内γ分泌酶抑制作用影响。有研究者在向肌源性干细胞中添加神经生长因子后Notch1基因表达量下降，进一步添加抑制剂后，Notch1表达量有所回升[27]。由此推测，Notch1与DAPT的相互作用可能受到诱导过程中添加的诱导因子作用影响。

综上，Notch信号通路通过激活Notch1受体与下游基因Ngn3共同调控体外诱导hUMSCs向胰岛前体细胞分化并进一步分化为胰岛内分泌细胞的过程，但两者存在的相互调节作用机制需进一步研究。