张玥，陈林，谢春，杨小雪，罗俊，罗喜荣

(1.贵州医科大学 贵州省特色天然药物资源高效利用工程研究中心 & 天然药物资源优效利用重点实验室，贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室，贵州 贵阳 550025； 3.黔南民族医学高等专科学校 药理学教研室，贵州 都匀 558013； 4.贵州医科大学 公共卫生学院 职业卫生与环境卫生学系，贵州 贵阳 550025； 5.黔东南州疾病预防控制中心，贵州 凯里 556000； 6.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

砷是广泛存在于环境中的有毒致癌金属元素[1]，近几十年，慢性砷暴露人群急剧增多[2-3]。长期砷暴露可致多系统损害[4]，砷主要蓄积在皮肤及肝脏，通过血脑屏障进入脑组织的砷很少，因此多年来对砷致中枢神经系统影响研究较少。砷中毒可以引起脑组织氧化损伤[5]、脑组织神经递质代谢酶紊乱[6]及脑中海马组织病理学变化[7]等损害。已有研究证实，砷中毒可以导致胆碱能系统的破坏[8]。因此改善砷中毒引起的海马组织病理学变化及保护中枢胆碱能系统功能可能是治疗砷中毒的有效措施。灵芝三萜类化合物(Ganodermalucidumtriterpenoids，GLT)具有广泛药理活性，如抗肿瘤、保肝排毒、抗HIV病毒以及降低胆固醇等作用[9-11]，作者所在课题组前期研究证实GLT对AD大鼠模型海马组织病理学病变有一定的调节保护作用[12]，并可调节胆碱能系统的平衡[13]。因此，本研究采用高、中、低3种浓度的GLT处理砷中毒模型动物，观察处理后模型动物海马组织形态学变化及GLT对模型大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性变化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

亚砷酸钠(NaAsO2)购自Sigma公司，GLT由中国科学院地球化学研究所超临界流体技术研究中心提取(GLT溶液用金龙鱼食用油溶解配制)，HE染色液购自北京Solarbio公司，4%多聚甲醛购自美国Bio-World公司，AChE试剂盒和ChAT试剂盒购买于南京建成生物工程有限公司。DMi 1倒置显微镜(德国Leica公司)、Microfuge ®20R冷冻离心机(美国Beckman coulter公司)、WP-UP-11-20超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)。

1.2 实验动物及分组

SD大鼠60只(贵州医科大学动物实验中心提供，批准号1503145)，体质量为(100±20)g，饲养于自然昼夜交替环境，在适应性喂养1周后，将其随机分为5组，每组12只，雌雄各半，分为正常对照组(生理盐水，10 mL/kg)、模型组(NaAsO210 mL/kg)、GLT低剂量组(GLT 0.25 g/kg+NaAsO210 mg/kg)、GLT中剂量组(GLT 0.50 g/kg+NaAsO210 mg/kg)、GLT高剂量组(GLT 1.00 g/kg+NaAsO210 mg/kg)，按上述各组给药剂量进行灌胃给药，1次/d，连续给药90 d。按照40 mg/100 g的麻醉剂量依组别把大鼠进行腹腔注射麻醉，并迅速断头处死，取出大脑以矢状面为界均分大脑为两半，其中一半脑组织，取视交叉后 5 mm厚的矢状位脑片(包含海马)。

1.3 观察指标

1.3.1脑组织中AChE、ChAT活性检测 每1 g脑组织中加入预冰的生理盐水9 mL，用匀浆器制备匀浆，离心备用。按照光化学法试剂盒提供方法步骤测定AChE，ChAT活性。

1.3.2海马苏木精-伊红(HE)染色观察 将分离出来的海马组织放入对应组别的小皿中(小皿中提前加入预冷的4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液)固定过夜，使用70%、85%及100%酒精进行梯度脱水，二甲苯透明20 min，常规石蜡包埋切片，HE染色，封片拍照。

1.3.3海马电镜切片观察 取出的海马组织经2.5%戊二醛固定2 h后，磷酸缓冲液清洗3次，1%锇酸固定1 h，70%、85%及100%丙酮分别脱水10 min，环氧丙烷浸透，环氧树脂包埋，聚合后超薄切片机切片，最后进行透射电镜摄片观察记录。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠脑组织匀浆中AChE、ChAT的表达

与正常对照组相比，模型组中AChE活力明显升高，ChAT活力明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。给予GLT干预后，与模型组相比，AChE活力明显降低，ChAT活力明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 GLT对大鼠脑组织AChE和ChAT活力的影响Tab.1 Effects of GLT on the AChE and ChAT activity in the brain of

2.2 大鼠海马组织HE染色结果

海马组织HE染色结果显示，正常对照组海马组织细胞数量多，形态完整，排列有序；而模型组海马组织细胞数量明显减少，排列重度紊乱，神经元结构变性部分脑组织出血；GLT低剂量组海马组织细胞数量与模型组相比，明显增多，细胞出现轻度紊乱；GLT中、高剂量组海马组织细胞数量及细胞形态趋近于正常对照组细胞。见图1。

正常对照组 模型组 GLT低剂量组 GLT中剂量组 GLT高剂量组图1 大鼠海马组织HE染色(40×)Fig.1 HE staining of hippocampus in rats(40×)

2.3 大鼠海马组织电镜观察

正常对照组海马组织细胞完整，核膜连续，细胞器丰富；而模型组海马组织细胞肿胀，细胞核膜不连续，细胞质内细胞器明显减少，线粒体肿胀、内质网破坏严重；当给予GLT干预后，细胞水肿明显减轻，细胞质内细胞器明显增多，内质网破坏及线粒体肿胀得以明显改善。见图3。

正常对照组(4 000×) 模型组(7 000×) GLT中剂量组(4 000×) GLT高剂量组(5 000×) 图2 大鼠海马组织透射电镜观察Fig.2 The transmission electron microscope examination of hippocampus in rats

3 讨论

砷中毒已经成为世界上的一个严重的公共卫生问题，特别是在孟加拉国、印度、中国和日本[14-15]。然而，全世界估计有1亿人通过饮用水接触过量的砷引起中毒，并且砷中毒几乎影响机体的每个器官系统，包括大脑。在许多流行病学研究中，砷中毒已被证明会增加神经系统紊乱的发生[16-17]。据报道，砷能够穿过血脑屏障，影响基底神经节，海马及大脑皮层受损[18]。大脑作为机体中最重要器官之一，大脑中的海马组织是机体进行学习记忆、认知等高级神经活动的重要区域[19]，当其受到砷中毒引起的病理学病变时，会导致机体学习记忆功能障碍、神经系统调节紊乱等一系列健康问题[20]。然而在本研究中发现在NaAsO2引起的砷中毒大鼠模型中，模型组大鼠海马组织发生严重病理学病变，如神经元变性、部分海马组织出血、海马组织结构排列紊乱以及胶质细胞增生。当给予GLT干预后，能够逆转砷中毒导致的海马组织的病理学病变，表明GLT能够对砷中毒引起的大鼠海马组织的病理学病变有一定的保护作用。

据文献报道，砷中毒后AChE活性升高[21]。另一项研究表明，AChE活性随着大鼠砷浓度的增加而活性升高[22]。这些报道均证实了砷中毒可以引起胆碱能功能异常。然而，在本研究中发现模型组大鼠中AChE活力明显升高，ChAT活力明显降低，当给予GLT干预后，能够显著抑制砷中毒引起的AChE活力升高，ChAT活力降低。

综上所述，砷中毒可以引起大鼠海马组织病理学病变的发生及胆碱能功能异常升高，GLT能够逆转砷中毒可以引起大鼠海马组织病理学病变及改善胆碱能功能，灵芝三萜类化合物GLT可能将会成为一个治疗砷中毒的潜在药物。