李晓杰，覃瑛，周谊霞,2**

(1.贵州医科大学 护理学院，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 病理科，贵州 贵阳 550004)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是目前引起全球因疾病死亡的主要原因，动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)作为常见的心血管疾病，是导致心血管病患者死亡的主要因素[1]。As以动脉内斑块形成为主要特征，可导致冠状动脉疾病、中风和外周血管疾病等多种并发症[2]。有文献表明，As的发生发展涉及内皮细胞损伤、巨噬细胞极化、泡沫细胞形成以及平滑肌细胞表型转化等几种机制[3],在这些机制中，血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cell, VSMCs)的表型转化失调被认为是As病变发生发展的关键因素[4]。在正常生理状态下，VSMCs表现出静止的收缩表型，合成活性低、很少增殖[5]。在炎症、机械损伤等病理生理学条件下，VSMCs表现出增殖表型[5]，具有高增殖和高迁移能力，从而有助于血管壁修复。然而，在动脉粥样硬化的发生发展过程中，VSMCs过度增殖会导致表型转化失调，促进动脉斑块形成[4]。因此，抑制VSMCs过度增殖，防止异常的表型转化已被认为是防治As的一种治疗方法。橙皮素(hesperetin,HES)是一种3′，5′，7-三羟基-4-甲氧基黄烷酮，属于黄酮类化合物，是柑橘类水果中含量最丰富的黄酮类化合物之一[6]。已有研究发现，HES具有降血糖、降血脂改善动脉粥样硬化的作用[6-7]，但其具体机制尚不清楚。本研究通过建立离体模型，观察HES对大鼠原代胸主动脉VSMCs的影响，从VSMCs表型转化的角度探讨其可能的机制，为临床上预防和治疗As提供一定的实验理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 4周龄健康雄性SD大鼠购自贵州医科大学动物房[合格证号为SYXK(黔)2018-0001]，1只，体质量85 g。

1.1.2主要试剂和仪器 Dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture F-12(DMEM ∶F-12)培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；美国Clark公司)，血小板源性生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB；美国R&D公司)，HES(中国Macklin公司)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(日本Dojindo化学研究所)，兔抗平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actin，α-SMA)和平滑肌22α(Smooth muscle 22α，SM22α；中国Proteintech公司)，兔抗弹性蛋白原(elastin，ELN；中国Affinity公司)，兔抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA；中国万类生物)，兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和抗兔二抗[goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP，武汉Servicebio公司]；CO2培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，酶联免疫检测仪(美国Bio-tek公司)，蛋白电泳仪(北京市六一仪器厂)及凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠原代胸主动脉VSMCs的提取 采用组织块贴壁法提取大鼠原代VSMCs。取SD大鼠，以0.7 mL/kg的剂量腹腔注射5%水合氯醛进行麻醉；75%酒精消毒皮肤，无菌环境下剥离并取出主动脉；主动脉放入盛有培养基的备用6 cm培养皿中，剥离外膜后用显微剪中间剖开血管；轻刮内膜，剪成1 mm×1 mm组织块贴于培养瓶底部，均匀分布，加10%FBS 4 mL；培养瓶底部朝上，置于含5%CO2和95%O2的37 ℃细胞培养箱内培养；1.5 h后将培养瓶反过来，使组织接触培养基继续培养；每2～3 d换液1次，3～5 d可见少量细胞从组织块爬出，2周左右长至培养瓶底部80%，待后续实验使用。

1.2.2大鼠原代胸主动脉VSMCs的培养与α-SMA的鉴定 取1.2.1项下对数生长期的VSMCs置于10%FBS的DMEM/F12培养基，5%CO2、95%O2及饱和湿度的37℃细胞培养箱中培养；每2～3 d换液1次，取第3代对数生长期的细胞进行鉴定，按5个/L密度均匀接种于铺有爬片的12孔板中，当密度长至70%时，采用细胞免疫荧光法对VSMCs标志性因子α-SMA进行鉴定。

1.2.3CCK-8法筛选药物浓度及细胞分组 将1.2.1项下对数生长期的VSMCs按5×106个/L的密度均匀接种于96孔板，待VSMCs长至70%时，血清饥饿24 h，使VSMCs处于生长静止期；加入2、5、10、25及50 μg/L PDGF-BB和10、50、100、150、200、250及300 μmol/L HES培养24 h，将CCK-8溶液与基础培养基按1 ∶9混匀孵育2 h，于450 nm处测定吸光度值，根据吸光度值筛选出PDGF-BB最佳造模条件和HES最佳干预浓度；根据上述结果将VSMCs设置为对照组(0 μg/L PDGF-BB)、造模组(25 μg/L PDGF-BB)及加药组(25 μg/L PDGF-BB+100 μmol/L HES)，待后续实验用。

1.2.4划痕实验检测VSMCs的细胞迁移 6孔板提前划好横线，每0.5cm划1条线；取1.2.3项下各组对数生长期细胞以5×108个/L的密度均匀接种于6孔板，待细胞融合度长至100%时用1 mL吸头垂直于横线划1条竖线，PBS清洗2次，血清饥饿24 h；加25 μg/L PDGF-BB和100 μmol/L的HES干预24 h，显微镜下记录0和24 h的细胞迁移情况，采用Image J计算细胞迁移率。

1.2.5Western blot检测VSMCs中α-SMA、SM22α、ELN和PCNA蛋白的表达 取1.2.3项下各组VSMCs经胰酶消化后，按5×108个/L密度接种于6 cm培养皿，待细胞融合度达到70%时血清饥饿24 h，加25 μg/L PDGF-BB和100 μmol/LHES培养24 h；PBS清洗2次，加RIPA裂解液冰上裂解提取总蛋白；BCA法蛋白定量后，120 V电压电泳至溴酚蓝跑到胶底部停止，220 mA转膜100 min，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，α-SMA、SM22α、ELN及PCNA一抗4 ℃孵育过夜，1×TBST洗3次、10 min/次，二抗室温孵育2 h，1×TBST洗3次、10 min/次，ECL发光液显影，采用Image J统计灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 原代平滑肌细胞的培养及鉴定

原代培养5 d有少量细胞从组织块中爬出、贴壁生长，传代培养2 d后细胞多呈长梭形，偶有三角形和星形，有典型的“峰-谷”状特征；用平滑肌细胞特异性因子α-SMA对平滑肌细胞进行免疫荧光鉴定，平滑肌细胞纯度>95%，高倍镜下可见与细胞长轴平行的肌丝。见图1。

注：A、B分别为光镜下原代培养5 d及传代培养2 d细胞形态(200×)，蓝色箭头指向“峰”、红色箭头指向“谷”；C(200×)、D(400×)为第3代培养2 d时免疫荧光鉴定结果。图1 大鼠原代胸主动脉VSMCs的培养及鉴定Fig.1 Culture and identification of rat primary thoracic aorta VSMCs

2.2 PDGF-BB对VSMCs的增殖作用

CCK-8检测结果显示，PDGF-BB处理24 h后VSMCs的活性呈浓度依赖性升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01，图2A)；Western blot检测结果显示，与空白对照组比较，25、50及100 μg/L组VSMCs的α-SMA和SM22α的蛋白表达水平分别明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，但3组PDGF-BB比较，差异无统计学意义(P>0.05，图2B和2C)，因此选择25 μg/L的PDGF-BB浓度作为体外造模的干预浓度。

注：A为CCK-8检测结果，B为Western Blot检测结果，C为蛋白表达的定量结果；与空白对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.001。图2 不同浓度PDGF-BB对VSMCs的细胞增殖的影响Fig.2 The effect of different concentrations of PDGF-BB on cell proliferation of VSMCs

2.3 HES对PDGF-BB诱导的VSMCs增殖的作用

CCK-8检测不同浓度HES对PDGF-BB刺激VSMCs增殖活性的影响，结果显示与空白对照组比较，造模组VSMCs增殖活性增强(P<0.001)；与造模组比较，除了浓度为10 μmol/L HES组外(P>0.05)，其余HES干预组VSMCs增殖活性均受到抑制(P<0.001)；当HES浓度≥100 μmol/L时，各实验组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，故后续实验选择浓度为100 μmol/L的HES作为加药组的干预浓度。见图3。

注：(1)与对照组比较，P<0.001；(2)与造模组比较，P<0.001。图3 不同浓度HES对PDGF-BB诱导的VSMCs增殖活性的影响Fig.3 The effects of different concentrations of hesperetin on the viability of VSMCs induced by PDGF-BB

2.4 HES对PDGF-BB诱导的VSMCs迁移能力的影响

划痕实验检测结果显示，与对照组比较，造模组VSMCs迁移率增加，差异有统计学意义(P<0.001)；与造模组比较，加药组VSMCs迁移率下降，差异有统计学意义(P<0.001)。见图4。

2.5 α-SMA和SM22α蛋白表达

Western blot实验检测结果显示，与对照组比较，造模组VSMCs的α-SMA及SM22α蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.001)，与造模组比较，加药组VSMCs的α-SMA及SM22α蛋白表达水平上升，差异均有统计学意义(P<0.001)。见图5。

2.6 ELN和PCNA蛋白表达

Western blot实验检测结果显示，与对照组比较，造模组VSMCs合成表型因子ELN和PCNA蛋白表达水平上升，差异均有统计学意义(P<0.001)；与造模组比较，加药组VSMCs的ELN、PCNA蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.001)。见图6。

3 讨论

据报道，CVD目前占所有死亡人数的40%以上[8]，As斑块的形成与破裂是导致CVD患者死亡的主要因素[9]。本课题组在前期研究中对临床血管性疾病人群进行了大数据的采集与统计分析，结果表明动脉血管的僵硬度与血流顺应性和血流动力学指标存在着明显的相关性[10]。血流动力学改变最先累及血管壁，血管壁损伤及血管内膜过度增生，最终会导致血管壁硬化、As形成，严重者会导致As斑块破裂，引发急性CVD[11]。目前对As斑块形成与破裂的机制研究存在多种观点，其中VSMCs的表型转化失调被认为是As病变发生发展的关键因素，高达70%的As病变与VSMCs表型转化密切相关[12]。病理状态下，由于动脉血管分泌过多的促细胞生长因子和趋化因子以及细胞外基质分泌增多，会导致中膜的VSMCs过度增殖、迁移及表型转化失调，参与As的发生发展[13]。因此，开发抑制VSMCs迁移、增殖及表型转化的方法已成为As研究中的一个迫切问题。

注：(1)与对照组比较，P<0.001；(2)与造模组比较，P<0.001。图4 HES对PDGF-BB诱导的VSMCs迁移能力的影响Fig.4 The effect of hesperetin on PDGF-BB induced VSMCs migration

注：(1)与对照组比较，P<0.001；(2)与造模组比较，P<0.001。图5 HES对PDGF-BB诱导的VSMCs α-SMA和SM22α 蛋白表达的影响Fig.5 The effect of hesperetin on VSMCs α-SMA and SM22α protein expression induced by PDGF-BB

注：与对照组比较，(1)P<0.001，与造模组比较，(2)P<0.001。图6 HES对PDGF-BB诱导的VSMCs ELN和PCNA蛋白表达的影响Fig.6 The effect of hesperetin on the expression levels of ELN and PCNA induced by PDGF-BB

探究VSMCs功能常用的细胞有原代细胞和细胞株2种，已有研究表明VSMCs细胞株随着传代次数增加，其固有的生理学特征往往会发生改变，不能很好地模拟体内生理状态，不利于As的深入研究[14]。为了保证VSMCs的性状和生物学特性接近预期生理状态，有学者于20世纪70年代提出分离原代VSMCs的方法[15]。VSMCs的原代培养方法有酶消化法和组织块贴壁法，因前者存在价格昂贵、消化时间和配比浓度不好把控、细胞获得量少及活性差的缺点[16-18]，故本研究采用组织块贴壁法提取SD大鼠胸主动脉VSMCs[19]。本研究原代细胞的提取过程中，将外膜剥离干净，刮去内膜，避免了内皮细胞和成纤维细胞的污染，确保了原代VSMCs的纯度；细胞分离与培养过程中，为了提高VSMCs的获得率和纯度，要注意以下几点：(1)为保证VSMCs的稳定性和生命力，选取4周龄身体健康的SD大鼠作为研究对象；(2)为提高VSMCs的活性，不可过度牵拉血管；剪组织的剪刀要尽可能锋利，使组织块边缘平整；(3)为了防止污染，全程应注意无菌操作；(4)原代培养前3天要绝对静置，不用换液。本实验建立了稳定的大鼠原代胸主动脉VSMCs体外培养模型，采用细胞免疫荧光化学法对VSMCs进行鉴定，纯度>95%，传代培养、冻存与复苏后，细胞仍然比较稳定，为后续细胞实验的开展奠定了基础。

PDGF能够调节血管形成，PDGF家族由5种类型或同源二聚体组成，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC及PDGF-DD[20-21]。PDGF-BB被认为是VSMCs从收缩表型向合成表型转化的最有效的刺激剂之一[22]。外源性PDGF-BB能刺激VSMCs分裂和增殖，加速细胞外基质和胶原的形成，从而缩短愈合时间[23-24]。本研究采用PDGF-BB诱导VSMCs增殖模型，CCK-8结果表明PDGF-BB处理后VSMCs增殖活性明显增加。有研究表明，PDGF-BB是VSMCs分裂所必需的元素，本质上PDGF-BB允许VSMCs跳过G1检查点进行分裂,在伤口愈合中扮演着重要的作用[25]。本研究中划痕实验结果表明 PDGF-BB能够显著增强VSMCs的迁移能力。

VSMCs含有1组特殊的细胞骨架蛋白，这些蛋白通常与细胞收缩有关，通常用作跟踪内膜增生、管腔狭窄以及As中发生的表型变化的标志物[26]。VSMCs最普遍的标志是α-SMA，这是典型的VSMCs肌动蛋白亚型，α-SMA在VSMCs中表达，即使在发育的早期也是如此[27]。其他常用的细胞骨架蛋白还包括SM22α、Calponin及非肌肉肌球蛋白重链亚型A和B[28]。然而合成表型的识别主要依赖于成熟或分化表型的细胞骨架标志物，其表达减少或缺失及增殖相关标志物(ELN和PCNA)的高表达。以往研究中，PDGF-BB通常被用来诱导VSMCs的表型转化[29]。本研究发现，PDGF-BB抑制了VSMCs收缩表型标志因子α-SMA和SM22α蛋白的表达，增加了合成表型ELN和PCNA蛋白的表达，表明PDGF-BB促进了VSMCs由收缩表型向合成表型转化。

HES是从柑橘、柚子及柠檬等芸香科中分离得到的天然黄酮类化合物[30]。已有研究证明HES具有明显的抗氧化、抗炎及抗增殖作用[31-32]。Jeong等[33]在动物高脂饲料中添加0.05% HES衍生物，喂饲10 d后发现HES衍生物具有明显的降血脂作用；Jayarman等[6]研究发现HES对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠具有降血糖、抗氧化和降血脂的作用，表明服用HES后可通过改善大鼠的抗氧化能力来减轻高血糖和血脂异常；Sugasawa等[7]实验表明，HES对APOE-/-小鼠As进展具有保护作用。本研究将HES应用于PDGF-BB刺激的VSMCs中，发现HES抑制了PDGF-BB对VSMCs的促增殖作用和促迁移作用；Western Blot结果表明加入HES后VSMCs收缩表型标志因子α-SMA及SM22α蛋白的表达上升，合成表型标志因子ELN和PCNA蛋白的表达下降，表明HES成功逆转了PDGF-BB诱导的VSMCs由收缩表型向合成表型转化这一过程。

综上所述，本研究发现HES可以明显抑制PDGF-BB诱导大鼠原代胸主动脉VSMCs的增殖和迁移，增加收缩表型标志蛋白α-SMA和SM22α的表达，降低合成表型标志蛋白ELN和增殖蛋白PCNA的表达。由此可认为，HES可以通过抑制VSMCs从收缩表型向合成表型的转化，从而逆转As的发生发展，可为As基础防治提供新的参考依据。