张雯霞，陈君灏，张 珏

0 引言

由于抗菌药物长期、大量使用，细菌耐药性逐渐增强，产超广谱β-内酰胺酶抑制剂(ESBLs)和碳青霉烯酶的阴性杆菌的大量出现，影响了其临床应用。产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌已在全球各地引起广泛的流行播散[1-4]。中国CHINET细菌耐药监测网近10年耐药性监测结果也显示，临床分离的肺炎克雷伯菌对亚胺培南或美罗培南的耐药率上升趋势最明显，由2005年的2.4%快速上升至2016年的18.6%[5]。

由于CRE菌株往往对绝大多数临床常用抗菌药耐药，其所致感染常伴随高病死率，使临床的抗感染治疗面临严峻的挑战。开发能够克服肺炎克雷伯菌耐药治疗的手段以治疗日益严峻的CRE所致感染迫在眉睫[6]。相关研究表明，碳青霉烯类药物联合其他抗菌药物治疗碳青酶烯类耐药肺炎克雷伯菌感染与单独使用碳青酶烯类药物治疗相比，联合治疗能够显著改善患者预后[7]。

痰热清注射液(TRQ)是我国广泛应用的经典复方制剂，由黄岑、熊胆粉、山羊角、金银花和连翅5种天然草本植物水溶性提取物组成，具有化痰解痉、镇咳平喘的功效，同时具有广谱抗菌和免疫调节作用[8-9]，且毒副作用小[10]。本研究针对目前临床常见的产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，探讨可用于临床针对此类耐药细菌所致感染的痰热清注射液和碳青霉烯类抗生素联合治疗的新方案。

1 材料与方法

1.1 菌株 本研究选择临床分离的20株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，菌株均已通过质谱方法进行鉴定，以PCR扩增及DNA测序方法确认碳青霉烯酶基因型别。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 药敏试验 微量肉汤稀释法测定痰热清注射液和亚胺培南对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度，实验方法和结果判读参考2018年版CLSI文件标准[11]。棋盘法联合药敏试验方法参考文献报道[12-13]，抑菌指数(Fractional inhibitory concentration，FIC)值的计算与判读参考文献标准[14]。FIC=MICA药联合/MICA药单独+MICB药联合/MICB药单独。FIC≤0.5为协同作用，0.52为拮抗作用。

1.3 联合杀菌曲线试验 根据联合药敏试验结果，按文献推荐方法进行联合杀菌试验[15-16]。操作步骤：将含1×105CFU/ml细菌的Mueller-Hinton肉汤与受试抗菌药单药或其联合混合后于35 ℃大气环境震荡孵育，同时以无药含1×105CFU/ml细菌的Mueller-Hinton肉汤作为生长对照。在0、2、4、6、8、10、24 h分别取样经系列稀释后涂布于Mueller-Hinton平板，35 ℃孵育过夜后进行菌落计数并绘制杀菌曲线图。联合药物组的细菌存活数量较单药降低 ≥ 2 log10CFU/ml判断该两药组合具协同杀菌作用。

2 结果

2.1 药敏试验结果 20株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率为100%，其MIC范围分别为4～256 mg/L，对痰热清注射液的MIC值为15.6～500 μl/ml。联合药敏试验结果显示，55%(11/20)的菌株对该两药组合呈协同作用，35%(7/20)的菌株呈相加作用，10%(2/20)的菌株为无关作用，所有菌株的联合皆未产生拮抗作用(见表1)。

表1 20株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对痰热清注射液和亚胺培南的MIC和联合药敏试验

2.2 联合杀菌曲线试验 选取联合药敏中FIC值较低的菌株K7和K17进行联合杀菌曲线试验，结果显示，这2株肺炎克雷伯菌在联合杀菌曲线试验中亦表现为一致的联合协同杀菌作用，菌株K7在两药联合后的4 h即开始出现联合协同杀菌效应，K17在两药联合后的6 h开始出现联合协同杀菌效应(见图1、图2)。在加药10 h后，协同作用为最佳，其中菌株K7、K17联合用药的细菌数量较单药痰热清注射液和亚胺培南分别平均降低了4.6、5.4 log10CFU/ml。

图1 肺炎克雷伯菌K7的24 h杀菌曲线图

图2 肺炎克雷伯菌K17的24 h杀菌曲线图

3 讨论

近年来，产碳青霉烯酶的广泛耐药肺炎克雷伯菌的出现给全世界健康卫生带来严峻挑战。由于缺乏有效的抗菌药物，导致临床治疗的失败率和病死率增加[17-18]。研究表明，碳青霉烯类药物联合其他抗菌药物治疗碳青酶烯类耐药肺炎克雷伯菌感染与单独使用碳青酶烯类药物治疗相比[7]，能够显著改善患者预后，如与替加环素或多黏菌素[19-21]、与阿米卡星[22]以及与磷霉素的联合[23]等均有报道，但很少有中药和亚胺培南的联合治疗方案。痰热清注射液治疗肺炎克雷伯菌引起的感染具有很好的疗效[24-25]。对痰热清注射液治疗社区获得性肺炎临床疗效的Meta分析发现，痰热清注射液与抗生素联合治疗CAP比单独使用抗生素疗效更好[26]。

肺炎克雷伯菌易形成生物膜，细菌一旦形成生物膜后，相比游离状态的细菌，细菌生物膜内的细菌对抗菌药物的敏感性明显降低，这是肺炎克雷伯菌易产生耐药的主要机制之一[27-29]。有研究表明，痰热清注射液能够抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的形成[30]，与阿米卡星联合用药后对铜绿假单胞菌耐药菌株的生物膜生长具有抑制作用[31]。本研究通过对20株产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌进行的中西医联合药敏试验发现，55% (11/20) 的菌株对痰热清注射液和亚胺培南联合呈现出协同作用，亚胺培南与痰热清注射液联合后，降低了亚胺培南的MIC值；部分菌株对亚胺培南单药表现为耐药，但与痰热清注射液联合后表现为敏感，如菌株K3、K12和K18。推测痰热清注射液通过抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成，从而提高了亚胺培南的直接杀菌作用。

为了证实联合药敏的协同作用，本研究挑选了2株协同作用较好的菌株进行杀菌曲线试验。结果显示，杀菌曲线试验结果与联合药敏试验一致，也具有协同杀菌效应，两株菌株在加药4～6 h开始出现协同作用，在加药10 h后，协同作用最佳，菌株K7和K17联合用药的细菌数量较单药痰热清注射液和亚胺培南分别降低了4.6、5.4 log10CFU/ml。但是在24 h后菌落数发生了反弹，表明细菌并没有完全杀灭。因此，我们建议临床上可以通过缩短用药时间来控制感染菌的复燃。

根据体外联合药敏试验及联合杀菌曲线来选择用药及确定给药时间，一方面可以获得预期的治疗效果，为临床提供精准的治疗方案；另一方面可以减少或避免单一用药产生的细菌耐药性。

仅依靠体外试验结果判断联合用药的协同作用具有局限性，我们要建立相关感染动物模型，探讨联合用药方案在体内治疗产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌所致感染的有效性，观察联合用药对动物感染模型的毒副作用及安全性评价，为临床针对该类耐药细菌所致感染提供依据。