卢 毅，林建喜，莫启旺，张 晓，俞 凌，岑 斌，俞鹏奎，吴极钟荣，邓金平

0 引言

前列腺增生又叫良性前列腺增生(Benign proststic hyperplasia，BPH)，是一种常见的中老年男性常见疾病，目前已经明确雄激素分泌过多是诱发前列腺增生的一个重要因素。近年来，有研究表明，前列腺增生可能和体内炎症因子的释放、上皮及间质细胞的异常增殖及前列腺组织细胞内相关蛋白的异常表达有关[1-5]。由于前列腺增生的发病机制尚不完全清楚，所以，目前对于前列腺增生的药物治疗方案尚不成熟，治疗前列腺增生的特效药物也非常有限[6]。盐酸小檗碱具有抗炎、抗微生物、抗心律失常、抗免疫、抗肿瘤等作用[7-9]，此外，盐酸小檗碱还具有收缩血管作用，减少组织器官充血水肿，抑制组织器官细胞异常增殖，缩小器官异常增大体积[10-12]。本试验采用丙酸睾酮诱导建立前列腺增生小鼠模型，考察盐酸小檗碱对丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的作用，并对其机制进行研究，为盐酸小檗碱在前列腺增生治疗中的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 昆明种小鼠40只，健康雄性，SPF级别，5～6周龄，体重(25±2)g，购买于长生生物技术有限公司，购买后进行72 h适应性饲养，自由进食、饮水。盐酸小檗碱购买自天津市永大化学试剂有限公司，VEGF、AKT、caspase-12和GAPDH抗体均购自Proteintech公司，RPMI1640培养基、RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司，ECL显色液购自Thermo公司，全自动生化分析仪购自北京岛津公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 前列腺增生小鼠模型的建立及给药 将40只雄性小鼠皮下注射丙酸睾酮5 mg/(kg·d)，连续注射21 d进行造模，造模期间小鼠正常饮食[13]。造模成功后，将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为模型组、盐酸小檗碱低剂量组、盐酸小檗碱中剂量组和盐酸小檗碱高剂量组，模型组按照20 ml/kg灌胃给予生理盐水，盐酸小檗碱低、中、高剂量组按照20 ml/kg分别灌胃给予10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml的盐酸小檗碱，所有组别每天定时给药1次，连续给药10 d。每天记录各组小鼠尿量，并于最后一次给药24 h后再次对所有小鼠进行称重。

1.3 血浆样品采集与处理 所有小鼠最后一次给药24 h后，通过眼眶后静脉丛取血至肝素润洗过的离心管中，室温静置5 min，然后置于离心机中，4 ℃、3 500 r/min离心10 min。取上清液进样至全自动生化分析仪，检测血样中TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β水平。

1.4 组织样本采集及组织蛋白的提取并计算脏器指数 颈椎脱臼处死小鼠后迅速分离前列腺组织，用生理盐水清洗，除去血液，滤纸吸干表面水分后称重，计算脏器指数。然后将一部分前列腺组织放入10%中性甲醛中固定，其余部分加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，置于4 ℃离心机以12 000 r/min离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并向其中加入上清液体积4倍的5×SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱中储存备用。脏器指数按照以下公式进行计算：

1.5 苏木精-伊红染色(HE)染色 将在10%中性甲醛中固定24 h后的前列腺组织转移至75%的酒精中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中浸蜡、包埋，进行5 μm切片，37 ℃水浴展开，捞片，沥干，放45 ℃恒温箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常规HE染色，在显微镜下进行组织病理学观察。HE染色步骤：①脱蜡:将石蜡切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；②复水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸馏水洗2 min，各2次,然后把水吸干；③苏木精染色：置于苏木精溶液中2 min，自来水流水冲洗2 min，把水吸干；④分化：1%盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，吸干水；⑤伊红染色:置于伊红溶液中2 min；⑥脱水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(I)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min；⑦封片：置于通风橱，待乙醇彻底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待载玻片上残留二甲苯挥干后用中性树胶封片。

1.6 Western blot 将冻存的前列腺组织蛋白液于室温下融化后，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经VEGF、AKT、caspase-12抗体(1∶1 000)孵育后，4 ℃过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，进行灰度值检测。

2 结果

2.1 盐酸小檗碱对丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠尿量及体重的影响 低、中、高3个浓度的盐酸小檗碱连续给药10 d后，各组小鼠累计尿量(各组小鼠10 d总尿量)及体重减轻值[体重减轻值=造模成功后小鼠体重(g)-实验结束时小鼠体重(g)]见表1，各组小鼠每日尿量变化见图1。结果表明，与模型组相比，盐酸小檗碱各剂量组小鼠累计尿量显著增加(P<0.05)，且随着盐酸小檗碱剂量的增加，前列腺增生小鼠累计尿量也逐渐增加，呈现出剂量依赖性，此外，随着给药时间的延长，盐酸小檗碱各剂量组小鼠每日尿量逐渐增加，而模型组小鼠每日尿量始终在基线附近波动；同时，实验结束时，与模型组相比，盐酸小檗碱各剂量组小鼠的体重减轻值呈剂量依赖性显著增加(P<0.05);提示盐酸小檗碱能够呈剂量依赖性地增加丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的累计尿量，且随着盐酸小檗碱给药时间的延长，前列腺增生小鼠的每日尿量也增加。

表1 各组小鼠累计尿量及体重减轻值比较(n=10)

图1 各组小鼠每日尿量变化

2.2 盐酸小檗碱对丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠体内炎症因子的影响 不同浓度的盐酸小檗碱对模型小鼠体内炎症因子的影响见表2。结果表明，与模型组比较，盐酸小檗碱各剂量组小鼠体内TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎症因子水平显著降低(P<0.05)，且呈现出剂量依赖性，即随着盐酸小檗碱给药浓度由10 mg/ml增加到40 mg/ml，前列腺增生小鼠体内的TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎症因子水平也不断降低。

表2 各组前列腺增生小鼠体内相关炎症因子水平比较(n=10)

2.3 盐酸小檗碱对丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠前列腺脏器指数的影响 盐酸小檗碱连续给药10 d后，各组小鼠前列腺脏器指数见表3。结果表明，与模型组比较，盐酸小檗碱能够呈剂量依赖性地降低丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的前列腺脏器指数(P<0.05)，降低前列腺体重占比。

2.4 盐酸小檗碱对丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的组织病理学的影响 模型组小鼠前列腺组织细胞形态改变，排列不整齐，细胞间隙缩小，可见结节样增生，前列腺组织出现明显锯齿样扩张，腺体乳头向腔内扩张明显，表明丙酸睾酮诱导前列腺增生小鼠造模成功；与模型组比较，盐酸小檗碱各剂量组细胞形态明显改善，细胞排列整齐，腺体乳头向腔内扩张明显缩小，盐酸小檗碱中、高剂量组前列腺组织细胞形态圆润，结节样增生少见，盐酸小檗碱高剂量组小鼠的前列腺组织腺体乳头无异常突出，见图2。

表3 各组前列腺增生小鼠脏器指数比较(n=10)

图2 各组小鼠的组织病理学观察结果(200×)

2.5 盐酸小檗碱对前列腺增生小鼠组织中VEGF、AKT及caspase-12表达的影响 盐酸小檗碱作用10 d后，前列腺增生模型小鼠前列腺组织中VEGF、AKT及caspase-12蛋白表达见图3。结果表明，与模型组比较，盐酸小檗碱各剂量组小鼠前列腺组织中VEGF及AKT表达量均显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，而caspase-12的表达量呈剂量依赖性显著增加(P<0.05)。上述结果提示盐酸小檗碱能够呈剂量依赖性地抑制丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠体内VEGF及AKT的表达，并呈剂量依赖性地促进caspase-12的表达，表明盐酸小檗碱对丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的作用机制可能是抑制前列腺增生小鼠体内VEGF的表达，从而抑制小鼠前列腺组织内新血管的生成，造成增生细胞缺氧，同时抑制前列腺组织细胞内AKT的表达，抑制前列腺组织细胞的异常增殖，同时促进前列腺组织细胞中凋亡蛋白caspase-12的表达，促进异常增殖细胞的凋亡。

图3 各组前列腺增生小鼠组织中VEGF、AKT及caspase-12的表达情况

3 讨论

前列腺增生是前列腺的一种非恶性的进行性生长现象，是老年男性最常见的泌尿系统疾病之一。虽然BPH-LUTS在短期内不是威胁生命的疾病，但它们给患者的日常生活带来了极大的尴尬和烦恼，并造成了巨大的经济负担[5]。

盐酸小檗碱是小檗碱的盐酸盐制剂，后者是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，是黄连抗菌的主要有效成分。近年来研究发现，盐酸小檗碱能够抑制体内TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎症因子的水平[7-9]，发挥其抗炎活性，在促进血管收缩的同时抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，使作用部位细胞长期处于缺氧状态[10-12]；此外，盐酸小檗碱能够抑制细胞内AKT的表达，抑制相关靶点通路蛋白的激活，从而抑制细胞的增殖[14-15]；还能够促进细胞中caspase-12的表达，促进细胞的凋亡，发挥其抗肿瘤作用[16-18]。

本研究结果表明，盐酸小檗碱能够呈剂量依赖性地增加丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的累计尿量，减少小鼠体内尿潴留，显著降低小鼠体重，改善小鼠病理状态，且随着盐酸小檗碱给药时间的延长，前列腺增生小鼠的每日尿量也增加；盐酸小檗碱能够明显降低丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠体内TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β等炎症因子的水平，改善小鼠的疾病状态，缓解病情；还能够呈剂量依赖性地显著降低丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的脏器指数，抑制前列腺增生的进展速度，改善丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的前列腺组织的病理状态，改善疾病转归，能够对已经发生病理改变的前列腺组织起到一定的逆转作用，且随着给药剂量的增加，其作用增强；并可能通过抑制前列腺增生小鼠体内VEGF的表达，从而抑制小鼠前列腺组织内新血管的生成，造成增生细胞缺氧，同时抑制前列腺组织细胞内AKT的表达，抑制前列腺组织细胞的异常增殖，同时促进前列腺组织细胞中凋亡蛋白caspase-12的表达，促进异常增殖细胞的凋亡。

综上所述，盐酸小檗碱能够抑制丙酸睾酮诱导的前列腺增生小鼠的前列腺组织的增生，其作用机制可能与调节前列腺组织中VEGF、AKT及caspase-12等蛋白的表达有关。