邢诒喜，陈维飞，姚奇岑，林千祺，梁 金，黄美琼，张瑞城

0 引言

肾脏间质纤维化是慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)发展至终末期肾病的必经之路，阻止肾脏间质纤维化即是保护肾功能、防治慢性肾病的主要药物治疗靶点[1]。依那普利(Enalapril)是临床上常用的血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)[2]，主要用于高血压、心力衰竭的治疗[3]，临床应用中发现，ACEI药物具有肾保护作用[4]。本研究应用单侧输尿管梗阻(Unilateral urethral obstruction，UUO)大鼠模型探讨依那普利对肾脏间质纤维化的抑制作用，并探讨其相关机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 依那普利片为江苏扬子江制药公司产品(批号：18102455)，水合氯醛钠为美国Sigma公司产品(批号：1810023313)，P65、TGF-β1、Smad3、Histone、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Abcam公司(货号：ab30186、ab22174、ab02871、ab30185、ab20117)，Masson 染色试剂盒购自美国Solarbio公司(批号：20180914)，奥林巴斯显微镜为日本Olympus公司产品(BX53MRF-S)，双垂直(DYCZ-25D)和转印电泳仪(DYCZ-40G)为北京市六一仪器厂产品。

1.2 实验动物 60只清洁级SD雄性大鼠购自海南医学院动物实验中心，6～8周龄，体重180～210 g，清洁级环境下适应性饲养3 d后，进行UUO模型制作。

1.3 实验造模、给药 参考本课题组的方法构建UUO大鼠模型[5]，简述如下：使用数值表法将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量[10 mg/(kg·d)]依那普利组(低剂量组)和高剂量[20 mg/(kg·d)]依那普利组(高剂量组)，每组15只。60只SD大鼠给予10%水合氯醛钠腹腔注射麻醉，假手术组暴露肾脏并分离出左侧输尿管后不结扎，关腹，缝合皮肤切口，模型组、依那普利组用4 号无菌丝线双重结扎左侧输尿管，关腹，缝合皮肤切口。假手术组和模型组每天给等量生理盐水灌胃，依那普利组给予相应剂量依那普利灌胃，持续14 d。

1.4 肾组织的HE和Masson染色 14 d后，断颈处死各组大鼠，取出患侧肾脏组织送我院病理科制作石蜡切片，常规HE染色，200×光镜下选取 10 个视野(左上、左下、右上、右下、中间各2个)计算肾小管损伤评分，肾小管上皮细胞空泡变性、萎缩、坏死<10% 1分、<25% 2分、<50% 3分、<75% 4分、≥75% 5分。Masson 染色严格按照试剂盒说明书操作，Image 多媒体彩色病理图像分析软件采集图像，计算Masson 染色阳性面积占整个视野面积的百分比，计算肾间质纤维化评分，百分比<10% 1分，<25% 2分、<50% 3分、<75% 4分、≥75% 5分。

1.5 Western blot检测 14 d后，断颈处死各组大鼠，取出50 mg患侧肾脏组织，液氮下研磨，加入蛋白裂解液，混匀后，100 ℃水浴20 min，蛋白定量后每份样品取10 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白电转移至PVDF膜，1∶1 000稀释入P65、TGF-β1、Smad3、Histone、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，加入二抗，使用碱性磷酸酯酶显色后，曝光目的条带。Bandscan 5.0软件扫描各条带，对照内参histone和β-actin计算各目的条带的相对灰度值。

1.6 统计学处理 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏的组织病理学改变 从图1可见，假手术组肾组织结构正常，模型组、依那普利组肾小球萎缩，肾小管扩张，上皮细胞空泡变性、坏死，可见蛋白管型，间质炎性细胞浸润。假手术组、模型组、低剂量组和高剂量组肾小管损伤评分分别为0.12±0.02、4.12±0.61、3.11±0.34、2.47±0.26，四组间比较差异有统计学意义(F=10.81，P<0.01)，其中依那普利组肾小管损伤评分显著低于模型组(P<0.01)，高剂量组显著低于低剂量组(P<0.01)。

2.2 肾脏间质的Masson 染色结果分析 从图2可见，模型组间质纤维显著增多，依那普利组间质纤维显著减少。假手术组、模型组、低剂量组和高剂量组肾间质纤维化评分分别为0.26±0.05、3.64±0.53、2.48±0.36、1.83±0.22，四组间差异有统计学意义(F=11.317，P<0.01)，其中，依那普利组肾间质纤维化评分显著低于模型组(P<0.01)，高剂量组低于低剂量组(P<0.01)。

图1 四组肾组织HE染色(200×)

图2 四组肾间质Masson染色(200×)

2.3 依那普利对NF-κB/TGF-β1/Smad3通路的影响 从表1可见，四组P65、TGF-β1和Smad3蛋白相对灰度值比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中依那普利组P65、TGF-β1和Smad3蛋白相对灰度值显著低于模型组(P<0.01)，高剂量组显著低于低剂量组(P<0.01)。图3显示了相应蛋白表达的变化。

表1 四组P65、TGF-β1和Smad3蛋白相对灰度值比较

图3 蛋白的Western blot检测

3 讨论

肾纤维化是CKD疾病慢性进展的主要病理变化，延缓肾间质纤维化成为CKD疾病治疗首要考虑的问题[6]。临床使用中发现，ACEI抑制剂使用者肾间质纤维化指标优于未使用者[7]，但对其作用机制未做深入研究，杨慧等[8]研究发现，依那普利可以阻止肾间质纤维化模型大鼠的肾小管上皮细胞凋亡，肾小管上皮细胞既是慢性炎症的受害者，同时受损的上皮细胞也可以分泌细胞因子参与到炎症中，保护上皮细胞，阻止炎症的级联放大[9]。本研究通过构建UUO大鼠模型，发现依那普利组肾小管损伤评分显著低于模型组，也说明依那普利对肾小管上皮细胞发挥保护作用，Masson染色分析依那普利组肾间质纤维化评分显著低于模型组，也说明依那普利可以抑制肾间质纤维化进程。

CKD疾病肾间质纤维化涉及到多种信号通路的激活[10]，其中TGF-β1在肾间质纤维化中起到关键的作用[11]，TGF-β1借助Smads家族中的转导分子转移到核内发挥基因调控作用[12]。Smad3是一个受体激活型小分子蛋白，可以促进TGF-β1信号转导[13-14]。本研究显示，模型组TGF-β1和Smad3蛋白显著高于假手术组，说明了肾间质纤维化TGF-β1/Smad3信号通路的激活，而依那普利组TGF-β1和Smad3蛋白低于模型组，说明依那普利可以抑制TGF-β1/Smad3信号通路。NF-κB是炎症和纤维化调控的上游通路，可以调节TGF-β1表达，P65是NF-κB通路中的关键蛋白，P65入核增多说明NF-κB通路的激活。本研究显示，模型组P65蛋白显著高于假手术组，说明NF-κB通路的激活，而依那普利组P65蛋白低于模型组，说明依那普利可以抑制NF-κB通路信号通路，对TGF-β1/Smad3的抑制有可能是通过抑制NF-κB通路实现的，具体机制还有待进一步的实验研究来阐明。