李 雪， 裴承斌， 杨玲玲， 何艳桃， 侯巧妮， 赵 帅， 虎 娜， 马会明

（1.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院宁夏人类精子库，银川 750004）

卵泡颗粒细胞属于生殖腺体细胞，围绕于卵细胞周围，是卵泡结构的重要组成部分，其增殖分化能够直接影响卵泡的发育、成熟、排卵、黄体形成以及激素分泌等卵巢功能[1]。表皮细胞生长因子（EGF）是一种具有多种生物学功能的小分子多肽，属于转化生长因子β（TGF－β）家族，对卵母细胞及其周围颗粒细胞具有保护作用，有利于卵母细胞的生长、成熟及发育[2]。目前研究表明[3]，体内卵泡发育和卵母细胞成熟期间，排卵前高水平的LH 促进了壁层颗粒细胞表达EGF 类因子，且通过旁分泌的方式作用于卵丘颗粒细胞EGFR，使其表达EGF 类因子。G1/S-特异性周期蛋白-D1（cyclin D1）和P21 是细胞周期调控因子，是分析细胞增殖能力变化的关键基因。P21能抑制cyclin D1 活性，导致细胞周期停止，阻断细胞的增殖过程，对细胞增长起负调控作用[4]。cyclin D1、P21 因子的作用机制与细胞生长增殖、凋亡和代谢密切相关。同时有研究表明[5-6]，cyclin D1 因子是卵母细胞旁分泌的产物，可以促进颗粒细胞生长增殖，调节卵泡刺激素的活性，促进蛋白酶及细胞因子的分泌，从而促进卵泡发育和成熟排卵。而P21 介导的级联效应则可以抑制细胞的增殖活性，从而使细胞失去分裂能力。本实验通过研究外源添加EGF 对人卵巢颗粒细胞细胞周期及cyclin D1 和P21 的影响，探讨EGF 能否通过细胞周期调控因子cyclin D1 和P21 促进人卵巢颗粒细胞增殖，为揭示EGF 对颗粒细胞的影响及其在卵泡发育中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源与细胞培养 选择2015 年5月—2017 年10 月于宁夏医科大学总医院生殖医学中心接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）或卵胞质内单精子注射（ICSI）治疗患者的卵泡液，卵泡液再经密度梯度离心和透明质酸酶消化后即为黄素化颗粒细胞。细胞用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的M199 培养基，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养细胞为贴壁生长，用0.25%的胰蛋白酶及0.02%的EDTA 消化传代培养。

1.1.2 主要试剂 MTT、EGF 01008 粉剂购自Sigma 公司；M199 培养基及培养用FBS（胎牛血清）购自GIBCO 公司；CCK-8 购自南京凯基生物公司；二甲基亚砜（DMSO）购自武汉博士德公司（化学纯）；0.25%胰酶、0.02%EDTA（乙二胺四乙酸钠）购自碧云天生物公司；DMEM/F12 培养基、胰蛋白酶购自Gibco 公司；青霉素和链霉素购自碧云天生物公司；cyclin D1 和P21 多克隆抗体购自abcam 公司；细胞周期试剂盒购自南京凯基生物公司；逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人卵巢颗粒细胞标本的采集和处理 患者取卵日收集第一管无血液浸染的澄清卵泡液，分装后以1500 r·min-1的转速离心10 min，弃去上清。将细胞沉淀加入PBS 并混为悬液，另准备淋巴细胞分离液以1∶1 的比例将细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上。以2000 r·min-1的转速离心30 min，小心吸出淋巴细胞分离液中层的颗粒细胞，加入5 mL PBS 溶液吹打清洗，1000 r·min-1离心5 min，共清洗细胞2 次，除去淋巴细胞分离液。所得的细胞沉淀用含100 μg·mL-1青霉素、100 IU·mL-1链霉素的M199 细胞培养基洗涤，再用50 μL 20%透明质酸酶重悬细胞沉淀，在37 ℃恒温水浴中消化10 min，加入含10%血清的培养液终止反应，反复吹打形成单细胞悬液，接种到25 mL 培养瓶、生长于含10%FBS 的M199 培养液中，于37 ℃、5%CO2、100%湿度的CO2孵育箱中培养进入对数生长期开始进行后续实验。

1.2.2 人卵泡颗粒细胞的鉴定 颗粒细胞是女性体内唯一表达卵泡刺激素受体（FSHR）的细胞[7]。本研究采用以FSHR 表达作为鉴定颗粒细胞的标准，通过细胞免疫荧光染色的方法检测FSHR 的表达。细胞固定及通透化处理与免疫组织化学过程相同，通透化处理后用PBS 洗涤5 min×3 次；滴加山羊血清封闭15 min，弃去液体；一抗FSHR 兔多克隆抗体（1∶200）孵育，4 ℃过夜，PBS 洗涤5 min×3 次；孵育荧光二抗（按1∶200 稀释）1 h，PBS 洗涤5 min×3 次；用DAPI染色液染核5 min，PBS 洗涤5 min×3 次；抗荧光淬灭封片剂封片后，于荧光显微镜下观察。

1.2.3 CCK-8 法测定EGF 作用于颗粒细胞的最佳浓度 利用检测细胞增殖和细胞毒性的Cell Counting Kit 试剂盒（简称CCK-8 试剂盒）检测颗粒细胞增殖情况。将颗粒细胞用含10%FBS 的M199 培养液配成单细胞悬液，密度调整为1×105个/mL，每孔100 μL 均匀接种于96 孔培养板上，设3 个复孔，培养24 h 后加入不同浓度的EGF（1、5、10、20、50 和100 ng·mL-1）继续培养24 h。每孔加入CCK-8 溶液20 μL，37 ℃继续孵育3.0 h，置Bio-Rad 酶联免疫检测仪上测定450 nm 波长处光密度（OD）值，取3 孔OD 平均值，重复实验3次，确定EGF 最佳作用浓度。

1.2.4 实验分组 对照组：人卵泡颗粒细胞培养过程中不添加EGF；实验组：人卵泡颗粒细胞培养过程中添加10 ng·mL-1EGF 作用24 h。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 颗粒细胞经10 ng·mL-1EGF 作用24 h 后，调整细胞浓度为4×105个/mL。1000 r·min-1离心弃去上清，加入1 mL PBS吹至细胞悬浮。过滤细胞悬液。重复2 次。后用200 μL 结合缓冲液再次震荡至细胞悬浮，加入500 μL 75%的乙醇预冷后固定4 h，以1000 r·min-1离心10 min并弃去上清。重悬细胞至500 μL PBS缓冲液中，避光孵育30 min。加PI 至终质量浓度为50μg·mL-1，室温避光30 min。用流式细胞仪上机检测后再用Modfit 软件分析颗粒细胞在不同细胞周期中所占的比例。

1.2.6 RTPCR检测颗粒细胞cyclin D1、P21mRNA 的表达 颗粒细胞经10 ng·mL-1EGF 作用24 h 后，提取各处理组细胞（约5×106个细胞）的RNA，并合成cDNA。从Genebank 中检索cyclin D1、P21mRNA 的序列，应用Primer5.0 软件设计的cyclin D1、P21基因引物。以合成的cDNA 为模板，cyclin D1、P21基因为引物做PCR。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳，后用凝胶成像系统进行半定量光密度扫描。（1）cyclin D1引物序列：上游5′- CTGGAGGTCTGCGAGGAAC-3′，下游5′-CTTAGAGGCCACGAACATGC-3′；（2）P21引物序列：上游5′-TGTCTTGTACCCTTGTGCCT-3′，下游5′-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3′；（3）βactin引物序列[8]：上游5′-CTGGGACGACATGGAGGAAA-3′，下游5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。

1.2.7 Western blot 技术检测颗粒细胞cyclin D1、P21 蛋白的表达 颗粒细胞经10 ng·mL-1EGF 作用24 h 后，加入预冷的裂解液，于冰上反复用1 mL注射器吹打裂解。BCA 法测定蛋白浓度，将总蛋白浓度调整至统一浓度后，按比例加入5×上样缓冲液，沸水浴8 min，上样量为30 μg 总蛋白，配制12%胶进行SDS-PAGE 电泳分离，电泳完毕后转膜至PVDF 膜上，用TBST 配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（1∶1000 比例稀释）4 ℃侧摆摇床孵育过夜，加入HRP 标记的二抗（1∶5000 稀释）室温孵育2 h，最后用ECL 化学发光试剂，X 线片压片曝光，以凝胶成像系统Quantity One 软件进行量分析（以与内参照β-actin 的灰度比值表示）测定cyclin D1 和P21 蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养人黄素化颗粒细胞培养及鉴定

人卵巢颗粒细胞倒置显微镜下形态学观察表明，实验分离培养的卵巢颗粒细胞存活率>90%。倒置显微镜下观察到初始阶段卵泡颗粒细胞形状呈圆形或椭圆形，细胞呈单层贴壁生长，生长速度较慢，培养24 h 内细胞贴壁、增殖（图1A）；培养48 h 后可见细胞增殖明显，贴壁良好，生长旺盛，细胞与细胞之间有细长的丝状突起相互连接。卵泡颗粒细胞在培养第2~5 天时处于分裂高峰；以后细胞逐渐变形、退化，表现为星形形态消失、丝状突起消失等。本实验采用细胞免疫荧光法检测FSHR 的表达，结果显示，FSHR 阳性染色定位于细胞胞质，呈红色，细胞核染色呈深蓝色，镜下见FSHR 的阳性率可以达到90%以上（图1B）。

2.2 EGF 作用于颗粒细胞的最佳浓度

用0、5、10、20 和40 ng·mL-1EGF 作用于颗粒细胞，与对照组相比细胞增殖活性均上升（P均<0.05）；10、20、40 ng·mL-1EGF 组细胞增殖活性均高于5 ng·mL-1组（P均<0.05），10、20、40 ng·mL-1EGF 组间细胞活性差异均无统计学意义（P>0.05），因此，经综合考虑选择10 ng·mL-1为颗粒细胞培养的最佳添加浓度，见图2。

2.3 EGF 处理对颗粒细胞周期的影响

周期实验结果显示：与对照组相比，10 ng·mL-1EGF 作用24 h 能增加G2/M+S 期细胞比例，减少G0/G1 期细胞比例（P均<0.05），见表1。

表1 细胞周期分布（x±s）

2.4 EGF 处理对颗粒细胞cyclin D1、P21 mRNA表达的影响

提取颗粒细胞RNA 后，以β-actin 为内参基因，经过RT PCR 方法检测，用cyclin D1和P21基因的特异性引物扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见颗粒细胞扩增产物分别在233 bp 和188 bp 处有特异性的条带，长度与设计的理论长度相符。EGF 处理后与对照组相比，cyclin D1mRNA 相对表达量升高，P21mRNA 相对表达量降低（P均<0.01），见图3。

2.5 EGF 处理对颗粒细胞cyclin D1、P21 蛋白表达水平的影响

添加10 ng·mL-1浓度的EGF 处理颗粒细胞后，Western blot 检测结果显示，与对照组细胞相比，实验组cyclin D1 蛋白的相对表达量升高，实验组P21 蛋白的相对表达量下降（P均<0.05），见图4。

3 讨论

随着体外受精-胚胎移植技术的不断发展，提高卵子、胚胎质量及临床妊娠率是生殖医学领域研究的热点和难点。颗粒细胞作为卵泡内重要的功能细胞，是雌激素和孕激素分泌的主要来源，对卵母细胞生长、卵泡发育、成熟及微环境的维持起重要作用，其数量减少和功能受损将引起激素的分泌不足，进而影响卵母细胞的生长和发育。颗粒细胞的凋亡常会引起卵母细胞的闭锁，促进颗粒细胞增殖，可以促进细胞的生长状态，使间隙连接蛋白的表达激活，从而促进与颗粒细胞紧密相关的生物学过程，如卵母细胞成熟、受精、早期胚胎体外发育等[9-11]。本研究以IVF-ET助孕方式治疗的患者为研究对象，分离纯化其颗粒细胞，研究EGF 对颗粒细胞增殖的作用。

EGF 能够促进颗粒细胞增殖和抑制FSH 的诱导作用，同时恢复减数分裂和促进细胞质成熟[12]，通过提高颗粒细胞增殖、卵泡液聚积和卵母细胞直径有利于卵泡生长。本研究采用CCK-8 法定性观察颗粒细胞生长和增殖情况，结果表明：添加10 ng·mL-1EGF 进行细胞培养后，细胞增殖能力增强。细胞的增殖都会经过细胞分裂周期来实现，本研究利用流式细胞仪定性观察颗粒细胞细胞周期情况，结果显示：EGF 刺激后可以显著促进细胞增殖，实验组G0/G1 期细胞所占比例减少，G2/M+S 期细胞所占比例增加，并促进G0/G1 期细胞向S 及G2 期细胞转变。研究表明，FSH 能够促进壁层和卵丘颗粒细胞表达EGFR，颗粒细胞EGF 类因子与EGFR 胞外区结合后能够使其细胞内的部分特定酪氨酸残基磷酸化，从而激活细胞内ERK1/2、PI3K 等下游信号通路[13]。本研究结果提示，EGF 促进颗粒细胞增殖可能是通过EGF与颗粒细胞表达的EGFR 受体结合，从而激活下游通路参与细胞增殖。

cyclin D1 和P21 是细胞周期调节因子。cyclin D1 作为重要的细胞周期正调控因子，主要参与细胞周期的基因突变和随后细胞周期G1/S期的转变。P21 是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）家族成员之一，可作用于细胞周期的G1 期。P21 是一种作用广泛的CDK 抑制因子，它通过与cyclin／CDK 蛋白激酶复合体相结合而抑制酶的活性，导致细胞周期停止，阻断细胞的增殖过程，对细胞增长起负调控作用[14-15]。基于以上理论，本研究探讨了EGF 能否通过周期调节因子cyclin D1 和P21 调控颗粒细胞的增殖，RT-PCR和Western blot 结果显示，与对照组相比，实验组cyclin D1 mRNA 和蛋白表达水平均增强，P21 mRNA 和蛋白表达水平均降低。已有报道[16]证实EGF 刺激细胞，能够促使细胞中cyclin D1 及其催化亚基CDK-4的表达增强，从而使得细胞周期缩短，增殖能力增强，促使细胞中P21 表达减少，从而使细胞增殖能力减弱，这种EGF 促进效果与本研究的实验结果一致。结果提示，EGF 作用于颗粒细胞后可通过与EGFR 受体结合，导致cyclin D1 表达增加，P21 表达降低，通过提高cyclin D1的表达、降低P21 的表达参与细胞周期的时相变化，加速细胞周期由G1 期向S期转变。

综上所述，本研究以IVF-ET 助孕方式治疗的患者为研究对象，添加10 ng·mL-1浓度的EGF培养颗粒细胞可通过增加cyclin D1 mRNA 和蛋白表达水平，降低P21 mRNA 和蛋白表达水平，从而促进颗粒细胞增殖。