张 弛， 陆俊铭， 周炳刚， 曹相玫

（1.宁夏医科大学第二附属医院，银川 750001； 2.宁夏医科大学基础医学院病理系，银川 750004）

三阴性乳腺癌是根据蛋白质水平的免疫表型特点而划分的一类雌激素受体、孕激素受体、人类表皮生长因子受体阴性的乳腺癌[1-2]，该类型具有高度侵袭性、转移早、易复发、生存期短、病死率较高[3]、易突变抗药的特点。常规药物治疗毒副作用强，对脏器损伤大。心房利钠肽（atrial natriuretic peptide ANP）是参与机体水盐平衡、调节血容量、维持心脑血管系统稳态的内源性激素。有学者已证实ANP 结合细胞膜表面受体后调节第二信使鸟苷酸环化酶参与细胞内多信号途径的生物调控活动，影响肿瘤增殖、分化、凋亡[4]。本研究应用ANP 干预三阴性乳腺癌细胞，观察细胞周期的变化及相关周期蛋白的表达，以进一步阐明ANP 抑制肿瘤的作用和机制，以期为ANP 的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 购于上海中乔新舟生物科技公司；ANP（批号CS-01-00605）购于杭州中肽生化公司；0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）、青链霉素混合液（100×）、SDSPAGE 凝胶制备试剂盒购于北京索莱宝科技公司；高糖型DMEM 培养基购于美国Hyclone 公司；MTT 试剂购于北京索莱宝公司；细胞周期检测试剂盒购于上海贝博生物科技公司；抗体（CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK4）购于中国affinity生物公司。

1.2 实验仪器

CO2细胞培养箱购于新加坡ESCO 公司；低温冷冻离心机购于德国Sigma 公司；C6 型流式细胞仪购于美国BD 公司；超净工作台购于美国Thermo 公司；凝胶化学发光成像系统购于上海勤翔仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与药物分组 将人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 以1×105个接种于25T 透气培养瓶中，用含10%胎牛血清的高糖培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，隔日换液，3～4 d 传代。培养至对数生长期后，弃去原培养液，更换含ANP 的培养基，按浓度分组，即对照组（ANP 0 μmol·L-1）和实验组（ANP 1 μmol·L-1、ANP 10 μmol·L-1、ANP 100 μmol·L-1），后续实验按分组进行。

1.3.2 MTT 实验检测细胞抑制率 消化对数期MDA-MB-231 细胞，离心重悬细胞计数，以1×105个/孔接种96 孔板，8 h 贴壁后，按实验分组，每孔更换含各浓度ANP 的培养基100 μL，常规培养24、48、72 h 后，再次更换含完全培养基90 μL和MTT 试剂10 μL 的混合液，另设空白孔常规培养4 h，吸弃上清，加DMSO 放置水平摇床10 min，促进蓝色结晶溶解，上机检测490 nm 处OD 值。抑制率=1-［（OD实验孔-OD空白孔）/（OD对照孔-OD空白孔）］×100%。

1.3.3 克隆实验检测细胞集落形成能力 将对数生长期MDA-MB-231 细胞以2000 个/孔接种在六孔板上，待8 h 贴壁后更换含不同浓度ANP培养基，干预48 h 后换常规培养基，培养14 d后，弃培养基，4%多聚甲醛常温固定30 min，结晶紫染色15 min，清水冲洗皿底，晾干后用数码相机自然光拍照。Image J 软件计数克隆形成。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.3.4 流式细胞仪（FCM）检测细胞周期 取对数生长期细胞经不同浓度ANP 干预48 h 后，离心收集5×106个细胞，冰PBS 洗两次，重悬，加入冰乙醇4 ℃固定过夜，离心去上清，冰PBS 洗两次，重悬，加入RnaseA 溶液20 μL，37 ℃水浴30 min，离心重悬细胞，加入400 μL PI 染液，吹打混匀，4 ℃避光孵育30 min，400 目尼龙网过滤，上机检测。增殖指数（PI）=（S+G2M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.3.5 Western blot 法检测周期蛋白 细胞经各浓度ANP 干预48 h 后，收集1×106个细胞离心提取蛋白，BCA 法定量，配制8%SDS-PAGE 凝胶，以蛋白浓度40 μg/10 μL 上样，300 A 恒流电泳后，120 V 恒压湿转PVDF 膜，TBST 洗膜后，10%牛奶封闭1 h，再次洗膜，孵育1：500 兔抗人一抗（CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK4），4 ℃过夜，TBST 洗膜，1：3000 山羊抗兔IgG 二抗，室温孵育1 h，洗膜，ECL 发光液与条带反应1 min后，上机曝光。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。各实验重复3 次，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANP 抑制MDA-MB-231 细胞生长

在不同浓度ANP（1、10、100 μmol·L-1）处理MBA-MD-231 细胞24、48、72 h 后，实验组细胞的生长抑制率较对照组均增加（P均＜0.01），见表1。

表1 各浓度ANP 在不同时间对MBA-MD-231细胞的生长抑制率（±s，n=3）

表1 各浓度ANP 在不同时间对MBA-MD-231细胞的生长抑制率（±s，n=3）

与对照组比较**P＜0.01

ANP 浓度/（mol·L-1）细胞生长抑制率/%24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 3.23±1.68** 9.88±2.62** 12.20±3.02**10 6.19±3.57** 18.05±5.82** 17.49±3.77**100 12.82±4.61** 31.94±8.52** 37.74±6.20**1

2.2 ANP 对MDA-MB-231 细胞的抗增殖作用

克隆实验用于检测癌细胞的集落形成能力，结晶紫染色后，数码相机自然光拍照可见，克隆呈深蓝色，针尖至针冒大小不等。克隆计数，与对照组相比，ANP 10 μmol·L-1、ANP 100 μmol·L-1组克隆形成数和克隆形成率均减少（P均＜0.05），且单细胞克隆面积小，染色浅。见表2、图1。

表2 各浓度组ANP 对MDA-MB-231 细胞克隆形成能力的影响

2.3 ANP 对MDA-MB-231 细胞周期的阻滞作用

FCM 检测结果显示，与对照组相比，各实验组MDA-MB-231 细胞的PI 均下降，细胞在G0/G1 期占比增加，S 期、G2/M 期占比减少（P均＜0.05），见表3、图2。

2.4 ANP 下调MDA-MB-231 细胞周期蛋白表达

Western blot 结果显示，ANP 可下调MDA-MB-231 细 胞 中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK4 蛋白表达。与对照组相比，ANP 10 μmol·L-1组和ANP 100 μmol·L-1组CyclinB1 表达均下调（P均＜0.05），ANP 1 μmol·L-1组、ANP 10 μmol·L-1组、ANP 100 μmol·L-1组CyclinD1 表达呈梯度下降（P均＜0.05），ANP 100 μmol·L-1组CDK1、CDK4表达均降低（P均＜0.01），见图3。

3 讨论

三阴性乳腺癌发病率逐年升高，发病呈年轻化趋势。常见的内分泌治疗和抗人类表皮生长因子受体2 抗体治疗都无效，对铂类、蒽环类、紫杉类的强效化疗仍具较高敏感性[5]，但长期使用易耐药、肝肾毒性高，因此开展分子靶向研究是三阴性乳腺癌未来治疗的趋势。心房利钠肽是心房合成分泌、由28 个氨基酸组成的活性多肽片段，能与心血管、肺、肾脏等细胞表面受体结合发挥相应的生物学作用，其中以抗肾素－血管紧张素－醛固酮系统、抑制垂体后叶加压素的合成释放及扩管、降压、利尿，改善心脑功能等作用在临床治疗中应用广泛[6-7]。通过大量实验证实，ANP 能降低胰腺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、肾癌等癌细胞数量，调节细胞周期，发挥抗增殖促凋亡作用[8-10]。对正常的体内脏器细胞无损伤，并缓解抗癌药的肝肾毒性作用[11]，临床应用安全、有效。

表3 各浓度组ANP 处理MDA-MB-231 细胞周期分布的变化（±s，n=3）

表3 各浓度组ANP 处理MDA-MB-231 细胞周期分布的变化（±s，n=3）

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

ANP 浓度/（mol·L-1） PI/% 各分期占比/%G0/G1 S G2/M 0 49.56±4.15 50.44±4.15 36.13±1.45 13.43±3.09 1 38.66±2.14** 61.34±2.14** 26.7±0.73** 11.94±1.71 10 32.97±3.00** 67.03±2.96** 24.83±4.46** 8.14±1.49*100 26.36±9.30** 73.63±3.28** 21.14±2.35** 5.22±1.01**F 值 28.069 28.067 17.468 10.547 P 值 ＜0.001 ＜0.001 0.001 0.004

本实验参考Vesely 等[9-11]研究ANP 抑制肺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤作用时一致使用的药物浓度梯度，将ANP 干预剂量1 μmol·L、10 μmol·L-1和100 μmol·L-1作为分组依据。为明确ANP 阻碍MDA-MB-231 细胞生长，经MTT 实验发现，各浓度ANP 的抑制作用在48 h 内梯度增高，在48 h 达高峰，说明ANP 能抑制细胞生长，但随后这种抑制能力的下降可能与ANP 半衰期较短或受生产工艺影响导致ANP 降解较快有关，故细胞克隆、FCM、Western blot 实验采纳细胞干预48 h 的结果。为验证ANP 抗肿瘤细胞增殖的作用，细胞克隆实验显示，ANP 抑制MDAMB-231 细胞克隆形成，随ANP 浓度升高，抑制率增加，呈浓度时间依赖，说明ANP 有抑制TNBC细胞增殖的作用。流式细胞仪检测ANP 对MDAMB-321 细胞周期的影响，结果显示，细胞在G0/G1 期占比较对照组升高，S 期和G2/M 期占比相应下降，PI 降低，说明ANP 可使细胞在G0/G1 期阻滞，降低DNA 合成，抑制细胞增殖。细胞周期是有机生命代代延续的微观过程，体现细胞从分裂完成开始到下一次分裂结束的子代形成方式，与细胞增殖、分化成熟、凋亡密切相关。研究恶性肿瘤的细胞周期调控机制有利于了解肿瘤演变，发现突变基因和表达调节的靶点，应用于临床诊断，指导治疗。细胞周期包括DNA 合成和有丝分裂。可分为G0/G1 期即DNA 合成前期，为DNA合成做物质储备；S 期即DNA 合成期；G2/M 期即DNA 合成后期，是DNA 合成结束向有丝分裂转变的时期[12]。在细胞分裂前，物质代谢复杂、活跃，由众多内源性因子调控，易受有害因素干扰，使细胞周期紊乱[13]。调节各阶段细胞周期有特定的周期蛋白（Cyclin）结合并激活相应周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs），促进周期向前进展[14]。细胞各时相特定的Cyclin/CDK 复合物有，G0/G1 期CyclinD1/CDK4复合物开启细胞周期循环的始动阶段，G2/M 期CyclinB1/CDK1 复合物实现细胞由合成向分裂的转变[15-16]。为了进一步明确对细胞细胞周期的影响机制，本文检测了CyclinD1/CDK4、CyclinB1/CDK1 蛋白相对表达量，显示均有不同程度下调，推测ANP 通过对细胞DNA 合成期和分裂期的干扰，使细胞阻滞在DNA 合成前期，细胞分裂增殖停滞，达到抗肿瘤目的。

在考察乳腺癌细胞的增殖，往往与正常乳腺细胞的生长成熟过程比较，细胞在生命周期周而复始的循环过程中，通过前期蛋白质合成、DNA复制和能量储备过程，进行后续有丝分裂，将遗传信息精准无误地传递到子代，肿瘤细胞则脱离正常细胞的反馈调控机制，出现增殖失控等特征[17]。本课题组从MDA-MB-321 细胞增殖力强的特点入手，通过MTT 和克隆实验，观察到ANP不仅抑制细胞生长，还能降低单细胞克隆形成力，具有阻碍细胞增殖效果。为明确这种作用产生的机制，本文研究ANP 对细胞周期是否产生抑制。FCM 实验发现，在多因子调控且合成代谢复杂的分裂间期细胞数量增多，猜测这种促使周期停滞的作用可能由调控该阶段的靶蛋白变化引起。进而用Western blot 法验证这一猜测。结果显示，调控G0/G1 期的CyclinD1/CDK4、G2/M期的CyclinB1/CDK1 复合物表达均降低，因而认为ANP 可通过调控细胞周期实现抑制MDA-MB-321 细胞增殖的目的。该研究为ANP 抑制肿瘤作用的机制提供了新思路，但细胞内信号通过因子间相互传递的过程尚未明确，仍需进一步探索。