梁嘉乐，彭伟康，陈诗曼，罗 芬，张志珍，马卫列，丁 航*

(1.广东医科大学 医学技术学院，广东 东莞 523808；2.广东医科大学 生物化学与分子生物学教研室，广东 东莞 523808)

儿茶，又名乌爹泥、乌垒泥、乌丁泥，为豆科植物儿茶的枝干或茜草科植物儿茶钩藤的枝叶煎汁浓缩而成的干燥浸膏。儿茶在我国应用广泛，早在明朝，《本草述》便对其有详细记载； 现代临床应用于小儿消化不良、腹泻、外用治疗溃疡、湿疹等 症。儿茶素为儿茶的主要有效成分，近年来已有的研究表明， 儿茶素类物质有抗癌、抗心律失常、调血脂、抗病毒等活性[1]。课题组前期已对儿茶的水溶性物质进行了提取，并在细胞水平观察了最大无毒浓度范围，本实验在此基础上，进一步研究儿茶水提物的体外抗甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的作用，以期为开发出高效安全、副作用小的抗流感病毒新药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

隔水式恒温培养箱(上海博讯公司)；CO2细胞培养箱(NUAIRE公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；细菌培养摇床(上海和程仪器制造有限公司)；多功能酶标仪(基因有限公司)；荧光分光光度仪(美国Bio-Rad公司)。

1.1.2 材料

中药儿茶浸膏购自东莞国药；犬肾(MDCK)细胞、293T细胞、pcDNA3.1质粒、甲型流感病毒反向遗传8质粒病毒系统、pHH-Gluc质粒由本室保存。DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；转染试剂(LipofectamineTM2000)购自Invitrogen公司；荧光素酶活性测定底物购自Promega公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司。其他的是国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MDCK细胞和293T细胞用含10% FBS的DMEM高糖培养基培养于10 cm细胞培养皿中，两天或三天传代一次。传代时吸出旧培养基，用0.25%胰酶溶液(含乙二胺四乙酸)消化细胞，镜下观察细胞分散变圆，快速将胰酶溶液吸出，加入2 mL DMEM完全培养基终止消化，用枪轻轻吹打细胞悬液后取适当体积的种回培养瓶中，5%CO2培养箱37℃培养，复苏传约3代后即可用于实验。

1.2.2 儿茶水性物质的提取

在500 mL超纯水中加入25 g已粉碎的中药材儿茶浸膏，60℃水浴浸泡24 h，然后回流提取两次(料液比：1∶20，提取温度：90℃，提取时间：2 h)，药液经浓缩、水提醇沉、过滤、除菌后保存于-20℃。提取方法见参考文献[2]。

1.2.3 甲型流感病毒(IAV)的制备

293T细胞和MDCK细胞(2:1)混养，接种于6孔板；培养24 h后，采用LipofectamineTM2000共转染IAV反向遗传8质粒系统，按照使用说明书进行转染。IAV制备及病毒TCID50值测定参考文献[2-3]。

1.2.4 CCK-8测定儿茶水提物对IAV增殖的抑制

MDCK细胞接种96孔板(3000个细胞/孔)，培养24 h后将各孔中的液体吸出，用空白培养基洗1次后进行实验。实验分3组，水提物处理组、IAV对照组和细胞对照组。水提物处理组和IAV对照组每孔加入0.1 mL的病毒稀释液(病毒用量为100 TCID50)吸附3 h后，吸出病毒液，用空白培养基洗1次；水提物处理组每孔加入0.1 mL不同浓度的儿茶水提物，设2、4、6、8、10、12、14 g/L浓度梯度，每个浓度设3个平行孔；同时IAV对照组每孔加入0.1 mL细胞维持培养基；细胞对照组加0.1 mL细胞维持培养基，都设3个平行孔。细胞培养36 h后，分别吸出各组的培养基，用空白培养基洗1次，加含10% CCK-8试剂的空白培养基0.1 mL，于培养箱孵育2 h后测定OD值。根据各组平均吸光度值计算儿茶水提取对IAV抑制率。

1.2.5 荧光素酶活性分析儿茶水提物抗IAV的感染

将2 mL的MDCK细胞接种6孔板，37℃培养24 h，利用LipofectamineTM2000转染pHH-Gluc质粒，以pcDNA3.1质粒作为对照。转染24 h后，消化细胞接种于96孔板中，3000细胞/孔，培养24 h后进行实验。实验分3组，水提物处理组、IAV对照组和细胞对照组。水提物处理组和IAV对照组每孔加入0.1 mL的病毒稀释液(病毒用量为100 TCID50)吸附3 h后，吸出病毒液；水提物处理组每孔加入0.1 mL不同浓度的儿茶水提物，设4、6、8、12 g/L四个浓度梯度，每个浓度设3个平行孔；同时IAV对照组每孔加入0.1 mL细胞维持培养基；细胞对照组加0.1 mL细胞维持培养基，设3个平行孔。培养36 h后从每孔吸取40 μL上清液，加入1 μL荧光素酶底物混匀，放入机器中检测，读取数据。根据各组的平均值，计算荧光素酶的相对强度。

1.3 统计学处理

统计分析由 SPSS 19.0 统计软件完成，实验结果均采用表示，实验重复3次，以P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 儿茶水提物对IAV增殖的抑制作用

CCK-8法测定结果见表1。IAV对照组抑制率为(32.46±2.19)%，儿茶水提取浓度在6～12 g/L时对IAV增殖的抑制率均在80%以上，与IAV对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。2、4、14 g/L时对IAV增殖的抑制率与IAV对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，儿茶水提物在2～14 g/L范围内时，能够显著抑制IAV的增殖，即具有抗IAV活性。

表1 不同浓度儿茶水提物对IAV增殖的抑制作用

2.2 儿茶水提物对IAV感染性的影响

实验结果表明，与IAV对照组相比，不同浓度处理组细胞的相对荧光强度均降低(P<0.05，P<0.01)，结果见表2。提示儿茶水提取具有抗IAV感染性的作用。

表2 不同浓度儿茶水提物对IAV感染细胞荧光素酶活性的影响

3 讨论

甲型流感病毒广泛存在于自然界，除感染人外，流感病毒在动物 体内也广泛存在，常常能引起人和动物的流感大流行，甚至出现死亡[4]。此外，甲型流感病毒表面抗原极易发生变异，导致病毒出现新的亚型，而人体往往无法产生抵御新生病毒的抗体，从而造成流感的全球性大爆发，所以甲型流感病毒是危害程度最高的一种流感病毒[4]。而目前临床使用的抗流感病毒药物对宿主细胞存在毒副作用及耐药性等缺陷[5]。因此，发展新型疗效好副作用少的抗流感病毒药物对于流感的防治十分重要。

我们前期已在MDCK细胞上观察了儿茶水提物的致细胞病变(CPE)，分析儿茶水提物的细胞毒性，确定儿茶水提物在1.00～15.00 g/L浓度内，对MDCK细胞有一定的安全性。本实验是在这个浓度范围内，通过CCK-8法和细胞荧光素酶活性检测法进一步探究提取物的抗IAV活性。CCK-8法的实验结果表明，儿茶水提物能够显著抑制IAV的增殖。而细胞荧光素酶活性检测法是用Gluc质粒转染MDCK细胞，然后吸附流感病毒，利用流感病毒的RNA聚合酶启动Gluc基因表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性间接测试儿茶水提物能否抑制流感病毒，如果药物组检测到的荧光素酶活性相比于阳性对照组降低，则说明药物抑制了病毒，如果检测到的荧光素酶活性与阳性对照组没有差别，则说明药物不能抑制病毒。本实验细胞荧光素酶活性检测法的结果是不同浓度水提物处理组细胞的相对荧光强度均显著降低，提示儿茶水提物具有很好的抗IAV感染性的作用。但是，实验中所用的是儿茶水溶性粗提物，下一步还需进行分离、纯化及鉴定，以获得明确的活性单体，来进一步研究其抗甲型流感病毒的活性及作用机制。