陈俊曦， 黄东辉， 左晓晖， 陈舒， 冼小燕

（佛山市中医院，广东佛山 528000）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是个体接触过敏原后，由免疫球蛋白E（IgE）介导的多种免疫细胞和炎症因子参与的鼻黏膜非感染性疾病，属于I型变态反应性疾病[1]。AR主要表现为反复发作喷嚏、流涕和鼻塞，严重影响患者的生活和工作。据调查，目前全世界约有5亿AR患者，患病率为10%～25%，我国患病率为18%[2]。目前，现代医学治疗AR主要以激素和抗组胺药物治疗为主，但副作用较明显，且效果不甚理想。辅助性T（Thellper，Th）细胞Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫失衡、嗜酸粒细胞（EOS）等在AR的发生发展中起到重要的作用[3]。AR归属中医学“鼻鼽”范畴，其病机主要为肺脾虚寒。黄芪桂枝五物汤具有益气温经作用，本课题组在临床实践中发现黄芪桂枝五物汤治疗AR具有良好的疗效，亦与多个研究报道结果一致[4-6]，但其机制尚不明确。因此，本研究观察黄芪桂枝五物汤加味对AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫失衡的影响，探讨其可能的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级健康Wistar雌性大鼠60只，6～7周龄，体质量180～200 g，购自广东省医学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK（粤）2018-0002。饲养于佛山市中医院中医药研究所，饲养环境：温度（23±2）℃，湿度（50±5）%。

1.2药物及制备黄芪桂枝五物汤加味方药组成：黄芪20 g，桂枝15 g，芍药15 g，大枣10 g，生姜10 g，辛夷15 g，五味子5 g。上述中药饮片均由广州致信药业有限公司提供。每付中药饮片加8倍量的水分别煎煮1.5 h和1 h，将2次药液混合浓缩至2 g/mL，4℃保存。氯雷他定片（由西安杨森制药有限公司生产，批号：20171123），加生理盐水配制成浓度为2 g/L的药液。

1.3试剂与仪器卵白蛋白（上海联迈生物工程有限公司，批号：2017120354）；氢氧化铝（上海源叶生物科技有限公司，批号：2018023417）；黏蛋白5AC（MUC5AC）、黏蛋白5B（MUC5B）、IgE、组胺、白三烯酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；干扰素γ（IFN-γ）ELISA试剂盒（美国ScienCell公司）；白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10 ELISA试剂盒（德国PromoCell公司）。Multiskan Sky酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4动物分组与模型构建将60只大鼠随机分为正常组（15只）和造模组（45只）。将造模组大鼠构建AR模型，参照周柳青等[4]方法：①基础致敏：卵白蛋白300 mg+氢氧化铝30 mg+生理盐水1 mL腹腔注射，隔日1次，共8次；②攻击致敏：基础致敏阶段末次腹腔注射结束后，隔日开始鼻内激发阶段。即2%卵白蛋白溶液滴入双侧鼻腔，每侧0.05 mL，1次/d，共7次。正常组大鼠基础致敏期间给予等体积的氢氧化铝30 mg+生理盐水1 mL腹腔注射，攻击致敏期间给予生理盐水双侧滴鼻。末次滴鼻30 min后观察大鼠抓鼻、喷嚏、流涕症状，进行鼻部症状评分，若总分＞5分，则判断AR模型建立成功[7]。造模组有39只大鼠符合AR模型标准，然后将其随机分为模型组（12只）、中药组（14只）和氯雷他定组（13只）。

1.5给药方法按照徐淑云主编的《药理实验方法学》中人鼠药物剂量换算公式[8]计算给药剂量。造模结束后，中药组给予黄芪桂枝五物汤加味10 g·kg-1·d-1灌胃，氯雷他定组给予氯雷他定生理盐水溶液1.05 mg·kg-1·d-1灌胃，正常组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，1次/d，共28 d。

1.6鼻炎症状评分[7]观察大鼠抓鼻、喷嚏、流涕症状。抓鼻（30 min次数）：1分（0～5次）、2分（6～9次）、3分（＞9次）；喷嚏（次/30 min）：1分（1～3次）、2分（4～9次）、3分（＞9次）；流涕：1分（流涕至鼻孔内）、2分（流涕出鼻孔外）、3分（流涕满面）。

1.7采用ELISA法检测大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平所有大鼠末次灌胃结束后，禁食不禁水16 h，以100 g/L水合氯醛腹腔注射处死，辅助动脉采血20 mL，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，-70℃保存。血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10、MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯ELISA检测方法的具体操作步骤按照各指标试剂盒说明书进行：将标准品和待测血清50μL分别加入反应孔内，然后加入50μL的标记抗体，37℃温育1 h。洗涤液清洗3次。每孔加入80μL的亲和链酶素-HRP，37℃温育30 min。洗涤液清洗3次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃温育10 min，加入50μL终止液后，应用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的光密度（OD）值。

1.8统计方法采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，实验数据均以均值±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠鼻部症状评分的比较表1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠鼻部症状评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和氯雷他定组大鼠鼻部症状评分明显降低（P＜0.05），且2个治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明黄芪桂枝五物汤加味可以改善AR大鼠的鼻炎症状。

表1 各组变应性鼻炎大鼠鼻部症状评分的比较Table 1 Comparison of the scores of rhinitis symptoms in various groups （±s，s/分）

表1 各组变应性鼻炎大鼠鼻部症状评分的比较Table 1 Comparison of the scores of rhinitis symptoms in various groups （±s，s/分）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组中药组氯雷他定组鼻部症状评分0.42±0.02 6.54±1.04①1.34±0.24②1.15±0.16②N/只15 12 14 13

2.2各组大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平的比较表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平明显升高（均P＜0.05）；与模型组比较，中药组和氯雷他定组大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平明显降低（均P＜0.05），且2个治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明黄芪桂枝五物汤加味可降低AR大鼠引起喷嚏、流涕、鼻塞等症状的物质含量，从而减轻鼻炎症状。

表2 各组变应性鼻炎大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平的比较Table 2 Comparison of the levels of serum MUC5AC，MUC5B，IgE，histamine and leukotrienes in various groups （±s）

表2 各组变应性鼻炎大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平的比较Table 2 Comparison of the levels of serum MUC5AC，MUC5B，IgE，histamine and leukotrienes in various groups （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组中药组氯雷他定组白三烯[ρ/（ng·L-1）]32.34±9.57 56.27±9.56①39.21±8.32②36.12±7.24②N/只15 12 14 13 MUC5AC[ρ/（pg·mL-1）]26.35±3.24 56.87±7.13①32.16±6.32②29.84±4.28②MUC5B[ρ/（pg·mL-1）]31.27±5.43 67.28±8.73①36.54±6.57②39.72±5.46②IgE[ρ/（pg·mL-1）]21.36±6.57 43.21±9.25①24.69±5.17②26.21±4.68②组胺[ρ/（μg·L-1）]11.38±1.27 24.38±3.64①12.17±1.65②11.62±1.53②

2.3各组大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比较表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17水平明显升高，IFN-γ、IL-2、IL-10水平明显降低（均P＜0.05）；与模型组比较，中药组和氯雷他定组大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17水平明显降低，IFN-γ、IL-2、IL-10水平明显升高（均P＜0.05），且2个治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明黄芪桂枝五物汤加味可调节AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫平衡，抑制炎症反应，从而起到发挥治疗AR的作用。

3 讨论

有研究表明，Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫失衡是变应性鼻炎（AR）发生的2种重要机制[9]。Th1/Th2和Th17/Treg细胞及其分泌的细胞因子在AR的发生发展中具有重要的意义。机体接触变应原后，经抗原呈递细胞传递给Th细胞并分化为Th2细胞，Th2细胞诱导B细胞分泌IgE，聚集在鼻黏膜。当变应原再次进入机体内时，与IgE结合，引起肥大细胞释放组胺、白三烯等物质，促进EOS浸润，释放高毒性阳离子蛋白，导致鼻黏膜上皮细胞损伤，引起毛细血管扩张，同时促进鼻黏膜腺体分泌MUC5AC、MUC5B黏液分泌过多，引起喷嚏、流涕、鼻塞等症状[10]。因此，MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯是导致AR大鼠出现喷嚏、流涕、鼻塞等症状的直接物质基础。IFN-γ和IL-2由Th1细胞分泌。IFN-γ可以抑制Th2细胞分泌IL-4和抑制IgE合成，是IgE强抑制因子[11]；IL-2可促进NK细胞增殖活化，抑制B细胞合成IgE[11]。IL-5和IL-4由Th2细胞分泌。IL-5可活化并促进EOS浸润和释放毒性蛋白，引起鼻黏膜腺体分泌、通透性增加[12]；IL-4可以活化B细胞，促进IgE的合成，同时可以促进EOS浸润[13]。IL-17由Th17细胞分泌，可促进多种炎症因子和趋化因子的合成，有较强的促炎作用[14]。IL-10由Treg细胞分泌，可抑制炎症因子合成和抑制嗜酸性粒细胞、肥大细胞释放组胺、白三烯等物质，减轻炎症反应[15]。因此，调节Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫平衡是治疗AR的重要途径。

表3 各组变应性鼻炎大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比较Table 3 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-17 and IL-10 in various groups[±s，ρ/（ng·mL-1）]

表3 各组变应性鼻炎大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比较Table 3 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-17 and IL-10 in various groups[±s，ρ/（ng·mL-1）]

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组中药组氯雷他定组IL-10 16.87±1.98 6.37±1.02①13.92±1.63②14.67±1.34②N/只15 12 14 13 IFN-γ 67.35±8.67 41.25±6.15①56.32±7.25②57.96±9.14②IL-2 6.87±1.03 3.06±0.69①6.15±1.13②6.62±1.24②IL-4 8.57±1.24 26.83±6.12①10.34±2.37②9.36±1.86②IL-5 2.63±0.15 4.67±0.39①2.78±0.41②2.86±0.34②IL-17 16.21±2.18 35.21±5.72①20.31±5.18②18.32±3.19②

AR属于中医学“鼻鼽”范畴，病位在脾、肺二脏，肺脾虚损，肺气虚寒，卫表不固，腠理疏松，脾气虚寒，化生不足，鼻窍失养，风寒乘虚而入，邪聚鼻窍，发为鼻鼽[16-17]。鼻鼽总属于本虚标实之病，虚在脾肺虚寒，实在风寒之邪。本研究所用的中药方是在黄芪桂枝五物汤原方基础上加辛夷、五味子而成，方中：黄芪补脾益肺，补在表之气；桂枝温阳散寒；芍药养血和营，调和营卫；大枣养血益气，助黄芪之功；生姜疏散风寒；辛夷疏风散寒，通塞利窍；五味子敛肺，防温药辛散太过。诸药合用，共奏益气温阳、宣通鼻窍之功。本研究采用卵白蛋白诱导大鼠AR模型，结果显示与正常组比较，模型组大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平明显降低（P＜0.05），血清IL-4、IL-5、IL-17、MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平和鼻炎症状评分明显升高（P＜0.05），提示成功建立大鼠AR模型，且AR大鼠存在Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫失衡。究其病机，AR细胞免疫失衡与中医正虚邪实具有高度相关性。介导保护性免疫的Th1和Treg细胞可以抑制炎症反应，加强免疫功能，而促炎的Th2和Th17细胞可以加重炎症，引发AR。因此，当体外环境因素作用于机体导致异常免疫反应，导致Th1和Treg细胞活性减弱，IFN-γ、IL-2、IL-10分泌减少（相当于“正虚”），Th2和Th17细胞分化增多，IL-4、IL-5、IL-17分泌增加，造成MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯等病理产物聚集鼻窍（相当于“邪实”），发为鼻鼽。经干预后，与模型组比较，中药组大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平明显升高（P＜0.05），血清IL-4、IL-5、IL-17、MUC5AC、MUC5B、IgE、组胺、白三烯水平和鼻炎症状评分明显降低（P＜0.05）。提示黄芪桂枝五物汤加味可调节AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫平衡，抑制炎性分子正常产生，降低炎性反应程度，得以“扶正祛邪”，从而改善AR的症状。

综上所述，黄芪桂枝五物汤加味可改善AR大鼠鼻炎症状，其机制可能与调节Th1/Th2和Th17/Treg细胞免疫平衡有关。