郭秀丽,赵丽花,庞永宏,梁建飞,牛斌,魏东

（1.张家口市农产品质量安全监督检验中心,河北张家口075000；2.康保县农业农村局,河北康保076650；3.张家口市食品药品检验中心,河北张家口075000；4.张家口市宣化区顾家营镇政府,河北张家口075100；5.河北北方学院河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室,河北张家口075000）

氯霉素（Chloramphenieol,CAP）属广谱抗生素,具有较好的抑菌性,曾被广泛应用于人类和动物疾病的治疗.但长期使用易引发再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、灰婴综合征以及消化系统、神经系统等疾病,造成严重后果[1].因此,世界上许多国家在法规中规定动物性食品中不得检出氯霉素.我国农业农村部在1999年发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》,规定所有食品动物的可食用组织中不得检出氯霉素[2],并于2002年公布了《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》,规定氯霉素禁止用于食品动物[3].目前,微生物法和色谱法是检测氯霉素的主要方法[4-6],但因微生物法测定需要较长的时间,且结果存在很大的误差,色谱法则需要价格昂贵的大型仪器等原因,这2种检测方法难以普及.近年来,免疫学检测方法因具有特异性强、灵敏度高、高效、快速、经济等优点,已成为氯霉素快速检测技术的研究和发展趋势.本研究利用课题组自制的CAP单克隆抗体和人工合成的包被抗原（CAP-OVA）,优化试验反应条件,建立了氯霉素间接竞争ELISA检测方法,以期为动物性食品中药物残留的快速检测技术开辟新的思路.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

氯霉素（CAP）购自中国兽医药品研究所；牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（简称：酶标二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CAP单克隆抗体、包被抗原（CAP-OVA）、羊血清为项目组自制；双组分TMB显色液购自北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯.

MULTISKAN MK3酶标仪（Thermo Multiskan FC）,美国Thermo Scientific公司；微孔板恒温孵育箱（ST70-2）,深圳市优米仪器设备有限公司；电子天平（JJ100）,北京赛多利斯仪器系列有限公司；96孔可拆酶标板,丹麦NUNC公司.

1.2 试验方法

1.2.1 包被抗原包被质量浓度确定和单克隆抗体稀释倍数选择 采用方阵滴定法[7]测定包被抗原包被质量浓度和抗体的最佳稀释倍数,将包被抗原由2.000 0 ng/mL开始按照2倍比稀释至0.062 5 ng/mL,纵向加入酶标板1-6列中,100μL/孔；将抗体先稀释2 000倍,按照2倍比稀释至64 000倍,横向加入酶标板A-F列中,100μL/孔,其余步骤同间接ELISA,选取测定结果OD值在1.0左右所对应的包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数为试验体系最佳包被抗原包被质量浓度和抗体稀释倍数.

1.2.2 包被抗原包被方式选择 按照1.2.1结果,分别选用4℃过夜,37℃1 h和37℃2 h三种不同的方式包被,进行间接ELISA测定,选择阳性与阴性OD值比值（P/N）较高的结果所对应的方式为最佳包被方式.

1.2.3 封闭方式选择 按照1.2.1和1.2.2结果,选择最佳的包被质量浓度和包被方式,进行封闭液和封闭时间的选择,封闭液分别选取1%的明胶、5%的脱脂奶粉、5%的羊血清、10%的羊血清.每孔添加200μL,用间接ELISA法测定OD值,选取P/N值高的为最适封闭液.封闭液确定后,分别选择37℃0.5 h、37℃1 h和37℃2 h三种封闭方式,通过间接ELISA法检测,选取P/N值高的为最佳封闭方式.

1.2.4 竞争反应温度和时间选择 把6块酶标板平均分成2组,室温反应组和37℃反应组,每组3块酶标板反应时间分别为0.5、1.0和2.0 h,进行间接竞争ELISA测定其OD值[8],选取在OD值在1.0左右为最适温度和反应时间.

1.2.5 酶标二抗最佳反应时间选择 按照说明书,将酶标二抗加入酶标板中,分别在37℃下孵育0.5、1.0、2.0 h.进行间接竞争ELISA测定,选取P/N值高的为酶标二抗最佳反应时间.

1.2.6 显色时间选择 按照前面所选择的条件进行间接竞争ELISA测定,分别在室温下避光显色5、10、15和20 min.用1 mol/L H2SO4终止反应,测定OD值,选取P/N值高的为显色时间.

1.2.7 标准曲线制作 将 CAP 稀释成 7 个质量浓度,分别为 1 000.00、100.00、10.00、1.00、0.10、0.01、0 ng/mL.按照所测定的最佳反应条件进行间接竞争ELISA测定.以CAP各个质量浓度的对数为横坐标,以各个质量浓度下所测的OD转化成的结合律B/B0（抑制率的倒数）作为纵坐标,制得CAP测定标准曲线,计算曲线回归方程与相关系数.

1.2.8 灵敏度确定 随机选择10个孔做零标准品间接竞争ELISA法,求10个孔OD值的标准差SD值,在标准曲线上找出对应（B0-2SD）的质量浓度即为此方法的最低检测限（灵敏度）.

2 结果与分析

2.1 包被抗原包被质量浓度和单克隆抗体稀释倍数

OD值在1.0左右时的包被抗原质量浓度为0.250 0 ng/mL,单克隆抗体稀释倍数为1∶32 000,为包被抗原最佳质量浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数.

2.2 包被抗原包被方式

包被抗原包被方式测定结果见图1.

由图1可知,37℃1 h时P/N值最高,选择37℃1 h为最佳包被方式.

2.3 封闭方式

封闭方式测定结果见图2和图3.

图2 封闭液确定Fig.2 Determination of theblockingsolution

图3 封闭时间确定Fig.3 Determination of the blocking time

由图2和图3可知,25%羊血清封闭时P/N值最高,封闭时间为37℃2.0 h时P/N值最高,因此,5%的羊血清37℃封闭2.0 h为最佳封闭方式.

2.4 竞争反应温度和时间

竞争反应温度和时间测定结果见表1.

表1 抗原抗体最佳时间确定Tab.1 Determination of the optimal timefor antigen and antibody

由表1可知,室温2 h和37℃1.0 h时,OD值都接近1,为了节约检测时间,选取37℃1.0 h为最佳反应温度和时间.

2.5 酶标二抗最佳反应时间

酶标二抗最佳反应时间测定结果见图4.

图4 酶标二抗反应时间确定Fig.4 Determination of reaction timeof enzymemarked antibody

由图4可知,1.0 h时P/N值最高,因此,选择1.0 h为酶标二抗最佳反应时间.

2.6 显色时间

显色时间测定结果见图5.

图5 显色时间确定Fig.5 Determination of color renderingtime

由图5可知,当显色时间为15 min时P/N值最高,所以,确定显色时间为15 min.

2.7 标准曲线

间接竞争ELISA测定结果见图6.用Excel软件分析数据,拟合的标准曲线方程为y=-10.7x+66.042,R2=0.996 9.

图6 Ci-ELISA测定法的标准曲线Fig.6 The standard curve of Ci-ELISA

2.8 灵敏度

灵敏度测定结果见表2.

表2 灵敏度确定Tab.2 Determination of sensitivity

由表2可知,在标准曲线上（B0-2SD）对应的质量浓度为1.01 ng/mL.0.1～100.0 ng/mL线性良好,故最佳检测范围为0.1～100.0 ng/mL.

3 结论与讨论

由于氯霉素的副作用对人体伤害严重,该药已被较多国家禁用.我国也禁止氯霉素用于所有食品动物,在动物性食品中不得检出.因此,检测方法对氯霉素的检测限越低越好,基于抗原抗体特异性反应的免疫学检测方法因其特异性强和检测限低的特性,成为我国禁用药物检测的主要方法.本文所采用的间接竞争ELISA检测方法是针对小分子药物检测的常用免疫学检测方法之一.

间接竞争ELISA检测方法中,操作步骤极其重要,其中任何一个条件不合适,都会影响整个试验结果.为了提高检测氯霉素残留的灵敏度和降低最低检测限,本试验对包被方式、抗体稀释度、封闭方式、酶标二抗反应时间及显色时间等进行了选择,通过优化操作步骤,有助于结果更加精确.本试验条件下,检测方法检测限较低,能够用于动物性食品中氯霉素残留的检测.尽管该检测方法具有一定的实用性,但由于在实际检测中还会遇到许多特殊问题,如样品前处理、环境、操作人员等因素,可能会出现假阳性的结果,需对方法进行进一步改进,从而保证结果的准确性.