张晓娜,周瑞金,张传来,扈惠灵,张应开,张鹏

（1.河南科技学院园艺园林学院,河南新乡453003；2.河南科技学院新科学院,河南新乡453003；3.河南省鄢陵县园林局,河南许昌461200）

在植物中雌雄异株的现象较为常见,尤其在栽培利用的植物中,雄株的存在会给前期生产带来较多的工作量,消耗大量生产成本,所以雌雄异株植物的性别鉴定对于研究和生产来说十分重要.但对于雌雄异株的果树植物来说,由于童期的存在造成早期性别鉴定变得比较困难.多年来许多研究者从不同的方向对果树的雌雄鉴定进行了探索,包括外部形态鉴定、生理生化差异、同工酶和特异蛋白差异、核酸水平差别等.

果树的性别研究最初是从外部形态开始的,但多数果树雌株和雄株之间在形态上没有太大的差异,必须到开花结果期才能够分辨出性别,因此根据树体的外部形态鉴定其性别受限较多.对于果树树体性别研究较多的植物是番木瓜,为了能够尽早区别番木瓜的性别,在栽培生产上提高经济效益,很多研究者对番木瓜的性别展开了研究,并从生理生化方面研究如何区分雌雄株.在番木瓜中,有研究者发现组培苗中雌株的酸性和碱性磷酸酶活力低于雄株[1],利用高效液相色谱法发现雌株和雄株间水溶性酚类物质有极显著差异[2],另外研究表明番木瓜雌株的RNA含量和组蛋白代谢水平高于雄株,也可以在一定程度上鉴别雌雄株.在银杏中发现内源激素在雌雄株中的含量也不尽相同[3].随着技术的发展和研究的深入,果树植物雌雄株的鉴别深入到了分子水平.越来越多的研究者在不同的果树植物中开发了用于性别鉴定的分子标记,如番木瓜[4]、猕猴桃[5-7]、银杏[8]、葡萄[9-10]、枣椰[11]等.如果能在植物中找到决定性别的基因,则可以直接用PCR技术鉴定雌雄性别,可加速果树植物的育种进度,减少管理成本,更好地促进产业的健康发展.

君迁子（Diospyros LotusL.）属于柿属植物,综合抗性较强,在柿子栽培生产上常常用做砧木,关于君迁子的分类研究比较少,对其进一步的开发利用非常不利.目前有研究者在柿属植物君迁子中通过混合群体分离分析法和分子标记（AFLP）找到了与雄性性状紧密连锁的DISx-AF4S标记[12].本试验利用DISx-AF4S标记通过PCR扩增技术鉴别君迁子实生后代的性别,为君迁子的童期性别鉴定、分类、柿属植物的育种与开发利用提供一定的参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用已知性别的8年生君迁子共51株,均来自河南科技学院东区试验基地,已开花,性别由前期田间花性调查得知,雌株23份,雄株28份.未知性别的君迁子幼苗、果实由国家柿种质资源圃（西北农林科技大学）提供,果实由自然授粉所得,其母株编号分别为：824,831,832,835,846,847,848,849,851,852,854,855,856,857,860,873,分别取出种子,播种在穴盘内,放在育苗室内培养,光照2 000～2 500 lx,光照/黑暗16 h/8 h,温度25±2℃,3个月后在每株君迁子上取叶片,装入取样袋中液氮速冻,置于-80℃冰箱中保存,备用.

1.2 试验方法

采用CTAB法提取113份君迁子叶片基因组DNA[14],试验方法略有改动.

试验采用与柿属植物雄性性别紧密连锁的DISx-AF4S标记检测君迁子植株的性别,所用DISx-AF4S 标 记 的 引 物 分 别 为 ：FDISx-AF4S（5’-ACATCCAAAGTTCTGGAGAATCA-3’）,RDISx-AF4S（5’-ATTGGTGCTTGGTCAAACATATC-3’）[15-16],引物由上海生工合成.20 uLPCR 配置体系为：10×缓冲液10 uL,dNTP混合物200μmol/L,正反引物各100 pmol/L,Taq酶2.5 U,模板DNA 2μg,剩余体积用双蒸水补齐.PCR反应程序为：94℃预变性4 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸40 s,共35个循环,最后72℃延伸10 min.用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,观察目的条带是否出现.

2 结果与分析

2.1 DISx-AF4S标记在君迁子性别鉴定中的准确率验证

为了解DISx-AF4S标记在君迁子性别鉴定中的准确性,用DISx-AF4S标记对已知性别的51株8年生的君迁子（23株雄株,28株雌株）基因组DNA进行PCR扩增,电泳结果见图1.DISx-AF4S扩增片段长度大约390 bp,与Akagi等的研究结果一致[13],结果可知23份雄株君迁子材料中有22份均扩增出了目的条带,对照雌株和水没有扩增出目的条带（部分结果见图1-A）,28株雌株君迁子均没有扩增出目的条带,而对照雄株扩出了特有的目的带（部分结果见图1-B）.由此可知供试的51份已知性别的君迁子植株中,利用DISx-AF4S标记的鉴定结果有50份与早期田间花性调查的结果一致,方法的鉴定准确率为98.04%.

图1 部分已知性别的君迁子材料基因组DNA DISx-AF4S标记PCR扩增结果Fig.1 Theresultsof disx-af4slabeled PCRamplification of genomic DNA of someknown genders

2.2 利用DISx-AF4S初步鉴别君迁子实生后代幼苗的性别

利用DISx-AF4S标记对113份来源于国家柿资源圃的君迁子实生后代幼苗进行PCR扩增,初步鉴定性别,部分试验结果见图2.由电泳结果可知,在113份材料中,有49份材料最终扩增出了DISx-AF4S标记目的条带,与已开雄花的雄株扩增条带相同,另外64份材料和雌株对照均没有DISx-AF4S目的条带出现.由此可初步判断在113份未知性别的君迁子后代中有49份是雄株,其余为雌株.

图2 部分君迁子实生后代材料基因组DNA DISx-AF4S标记PCR扩增电泳结果Fig.2 Theresultsof disx-af4slabeled PCRamplification and electrophoresis of genomic DNA of someprogenies of Date plum

3 结论与讨论

为了研究君迁子和柿属植物的性别鉴定方法,研究者一直在不懈地工作.在柿属植物中利用混合群体分析法和AFLP技术发现了DISx-AF4S标记,该标记是柿属植物中与雄性性别紧密连锁的SCAR标记.在利用DISx-AF4S鉴别君迁子性别的准确性试验中,51份供试君迁子材料中有1份材料的鉴定结果与早期的田间性别调查结果不一致,编号为6的电泳结果没有出现DISx-AF4S标记的目的条带,试验结果显示6号是雌株,后期经过田间花性调查发现该株君迁子确为雌株,可能是该株君迁子在前一年移栽时因人为原因混在了雄株中,导致了试验结果与田间观察结果不一致.由此可见,用DISx-AF4S标记鉴定君迁子准确率要高于98.04%,应该可达100%.所以,DISx-AF4S基本可以在早期准确地鉴定君迁子的性别.本试验中,利用DISx-AF4S标记鉴定了113份未知性别的君迁子实生后代幼苗,电泳结果表明有49份材料扩增出了DISx-AF4S标记目的条带,其余未出现目的条带,基本可以认定113份材料中雄株49株,雌株64株.但由于君迁子植株还处在童期没有开花,其实际的性别还需待开花后才能够进一步确定.君迁子性别的早期鉴定对其群体分类、优良单株的筛选和开发应用提供了一定的基础与参考.