李婉华，李锡晶，张婷，沈洪昇，张桂贤，刘洪斌

1天津医科大学，天津 300070; 2天津市医药科学研究所

肝内胆汁淤积是指由于多种原因引起胆汁分泌受阻的病理状态，持续的肝内胆汁淤积使胆汁流入十二指肠减少，导致肠道胆汁缺乏和血中胆汁成分增多，从而引发胆汁淤积性肝病及相应的全身症状[1]。常见的胆汁淤积性肝病包括原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、自身免疫性肝病和药物性胆汁淤积等。目前临床上尚无疗效确切且稳定的治疗药物[2]。在中医学中，胆汁淤积性肝病属“黄疸”范畴[3]，治疗多从清热利湿退黄角度出发。活血清解灵由茵陈、丹参、大黄、白头翁、败酱草、甘草六味中药组成，茵陈清热利湿，利胆退黄，丹参活血祛瘀；白头翁与败酱草清热解毒，祛瘀排脓，大黄逐瘀通经，利湿退黄，甘草味甘性平[4]。胆汁是一种由肝细胞生成、胆管上皮细胞吸收和转运进入十二指肠参与代谢的复杂水溶液[5]。胆汁酸是胆汁重要的组成成分，其由胆固醇合成，在驱动胆汁流动，清除体内代谢废物，促进脂质的消化吸收和调节胆固醇代谢等方面起重要作用[6]。近年来研究发现，胆汁酸作为一种信号分子通过与法尼醇受体(FXR)、G蛋白偶联受体(TGR5)的结合及通过肝肠循环广泛调节脂质代谢、免疫功能和肠道菌群[7～9]。既往少见对于胆汁淤积时各胆汁酸成分及胆汁酸代谢的研究。2018年9月～2019年10月，我们通过测定胆汁淤积性大鼠胆汁中18种胆汁酸成分含量，探讨活血清解灵对胆汁淤积性肝病胆汁酸代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级Wistar雄性大鼠36只，体质量(220±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号11400700347254，饲养环境12 h光照与黑暗交替循环，温度(22±3)℃，相对湿度(50±10)%，普通饲料喂养，自由进食饲料和水，实验前适应性喂养1周。药物与试剂：ANIT购自美国Alfa Aesar公司；复方甘草酸苷胶囊购自瑞阳制药有限公司；活血清解灵配方颗粒由茵陈、丹参、大黄、白头翁、败酱草、甘草组成，购自北京康仁堂药业有限公司；石胆酸(LCA)、去氧胆酸(DCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)、甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)购自加拿大Toronto Research Chemicals公司；鹅去氧胆酸(CDCA)、胆酸(CA)、熊去氧胆酸(UDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA)购自中国食品药品检定研究院；牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨去氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、甘氨胆酸(GCA)、去氢胆酸(DHCA，内标)、色谱纯甲醇和甲酸均购自美国Sigma-Aldrich公司，抗体NTCP和羊抗兔二抗购自美国Abcam公司，抗体tubulin和羊抗鼠二抗购自美国proteintech公司。仪器：岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用系统；色谱柱：InertSustainC18柱(3.0 mm×100 mm, 3.0 μm)；AB135-S型十万分之一电子分析天平(Mettler Toledo公司)；KQ5200B 型超声波清洗器 (功率200 W，频率40 kHz，昆山市超声仪有限公司)，TBA2000-FR全自动生化分析仪(日本东芝公司)。

1.2 动物造模及给药 将48只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、复方甘草酸苷胶囊组、活血清解灵低、中、高剂量组。ANIT用橄榄油溶解，以ANIT(100 mg/kg)灌胃1次，制备胆汁淤积性肝损伤模型。复方甘草酸苷胶囊及活血清解灵配方颗粒均用蒸馏水加热溶解,复方甘草酸苷胶囊组予复方甘草酸苷胶囊22.5 mg/kg，活血清解灵低、中、高剂量组分别给予活血清解灵4.1、8.1、16.2 g/kg，在造模后开始灌胃给药，连续4 d。

1.3 标本采集及处理 给药第5天，3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，大鼠取仰卧位固定，开腹，胆管插管取胆汁，储存于-80 ℃用于LC-MS/MS检测各胆汁酸含量。腹主动脉取血，静置凝固后离心取上清送至天津市南开医院检验科检测总胆红素(IBI)和总胆汁酸(TBA)含量，留取大鼠肝组织储存于-80 ℃用于Western blotting实验。

1.4 胆汁酸测定 通过高效液相色谱—质谱联用法测定胆汁酸成分含量。①空白胆汁的制备:将大鼠胆汁(200 μL)用生理盐水稀释10倍，然后加入0.3 g活性炭，涡旋1 min，4 ℃过夜，将混合物离心(12 000 r/min)20 min，收集上清液，重复2次，将该上清液作为无胆汁酸空白胆汁[10]。②标准溶液配制:准确称量各标准品于容量瓶中，用空白胆汁分别将其配置成1 mg/mL单标储备液，从各单标储备液中移取一定量用空白胆汁配制成混标储备液，DCA、LCA配制浓度为2 μg/mL，TUDCA、GUDCA、THDCA、GHDCA、UDCA、HDCA、TLCA、GLCA、CDCA配制浓度为4 μg/mL，CA、GCDCA、TDCA、GDCA配制浓度为8 μg/mL，TCA、GCA配制浓度为16 μg/mL，TCDCA 配制浓度为24 μg/mL，内标DHCA配制浓度为400 μg/mL，标准溶液均于4 ℃条件下储存。③样品处理:移取胆汁样品20 μL至2 mL离心管中，用生理盐水稀释10倍，加入10 μL内标，加入600 μL乙腈，涡旋1 min，离心(12 000 r/min)10 min，取上清于氮气流下吹干，取流动相200 μL复溶，离心(12 000 r/min)10 min，取上清过滤膜，取70 μL移至进样瓶中[11]。④色谱条件:色谱柱：InertSustainC18柱(3.0 mm×100 mm , 3.0 μm)，流动相：0.01%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脱(0～20 min，60～70%B，20～30 min，70～90%B)，流速：0.4 mL/min，柱温：35 ℃，进样量：20 μL。⑤质谱条件:岛津LCMS-8040液质联用仪，离子源: ESI，负离子模式，加热模块温度: 400 ℃，DL温度: 250 ℃，雾化气流速: 3.0 L/min，干燥气流速: 15 L/min，离子源电压: 4.0 kV，扫描模式: 多反应离子监测(MRM)。

1.5 肝组织中NTCP蛋白表达检测 采用Western blotting法。取肝组织称重，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上进行超声破碎，13 000 r/min离心10 min，取上清，用BCA试剂盒进行蛋白定量，将蛋白提取液于95 ℃金属浴中加热15 min，每个孔蛋白上样量为50 μg，蛋白用SDA-PAGE电泳分离，转膜，室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，各条带分别孵育一抗抗体NTCP(1∶1 000)和α-tubulin(1∶5 000)4 ℃过夜，洗膜，室温下分别孵育羊抗兔二抗(1∶8 000)，羊抗鼠二抗(1∶1 000)1 h 30 min，洗膜，加入ECL发光液于化学发光分析仪中曝光。以α-tubulin为标准化参考物，用Image J软件测量各条带灰度值。

2 结果

2.1 各组血清IBI和TBA水平比较 见表1。

表1 各组血清IBI和TBA水平比较

注：与空白组相比，*P<0.01;与模型组相比，#P<0.05,##P<0.01。

2.2 活血清解灵对胆汁中胆汁酸浓度的影响 见表2。

表2 各组胆汁酸浓度比较

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01;-表示未测出。

2.3 活血清解灵对大鼠肝组织NTCP蛋白表达影响 对照组、模型组、复方甘草酸苷胶囊组、活血清解灵低剂量组、活血清解灵中剂量组、活血清解灵高剂量组NTCP相对表达量分别为1.34±0.08、0.73±0.17、0.93±0.23、0.88±0.23、1.08±0.09、1.26±0.04，与对照组比较，模型组NTCP表达降低(P<0.01)；与模型组比较，活血清解灵高剂量组NTCP表达增高(P<0.05)。

3 讨论

胆汁淤积性肝病病因复杂，常见病因包括病毒、细菌、药物/毒物、寄生虫和自身免疫等。其临床症状多表现为黄疸、皮肤瘙痒、脂肪泻、乏力和骨质疏松。病情发展最终常导致高胆红素血症，重者可导致肝衰竭[12]。活血清解灵通过缓解胆汁淤积，降低血胆汁酸浓度，从而减轻胆汁淤积引起的临床症状和肝脏损伤。

胆汁酸作为一种两亲性的清洁剂类分子，是胆固醇在肝脏代谢的终产物，当其在肝脏内的浓度积累到一定程度后，会产生肝细胞毒性，其毒性大小受到胆汁酸分子疏水性的影响。当发生胆汁淤积时，胆汁酸不能正常转运进入胆汁，而是通过肝细胞回流进入血液，导致胆汁中的胆汁酸成分减少，而血中的胆汁酸浓度则会增加10～20倍。本研究选择了常见的18种胆汁酸进行检测，其中包括6种与甘氨酸结合的胆汁酸和6种与牛磺酸结合的胆汁酸。在胆汁和和肝脏的胆汁酸池中，与牛磺酸和甘氨酸结合的胆汁酸占比超过90%[13]。本实验中共检出16种胆汁酸，其中LCA和HDCA在胆汁中含量较低，仅在正常组中测出。除TCDCA外，其余13种胆汁酸在模型组中均有不同程度降低，在经过活血清解灵治疗后均显示出上升趋势，尽管其中部分胆汁酸上升趋势不明显。TCDCA是一种强疏水性胆汁酸，具有较强的细胞毒性作用，在本实验结果中，TCDCA与其余13种胆汁酸表现出相反的趋势，模型组中显著增高，过去研究普遍认为胆汁酸的毒性作用会造成肝细胞和胆管细胞的损伤，而本实验结果表明，这种细胞毒性作用可能是由某些特定的胆汁酸引起的，TCDCA在胆汁中的累积会进一步加重胆管上皮细胞的损伤，进而引起胆管结构的破坏，而活血清解灵高剂量组的TCDCA表现出显著下降趋势，表明其有效干预了胆汁酸谱的组成，降低了具有细胞毒性的胆汁酸浓度，从而有效保护了肝损伤。

研究证明，部分中药及中药成分可通过调节胆汁酸代谢相关信号通路影响胆固醇-胆汁酸的代谢[14]。胆汁酸在肝内代谢的主要转运蛋白包括负责胆汁酸向肝外转运的胆盐输出泵(BSEP)和肝肠循环中负责胆汁酸经门静脉转运入肝的NTCP。本实验选用的造模药物ANIT可显著抑制BSEP的活性[15]，使得胆汁酸流入胆汁障碍。而Western blotting结果表明，模型组中NTCP含量显著降低，显示胆汁酸在肝肠循环回流入肝时出现了转运障碍，从而进一步加重了胆汁酸在血清中的累积，而经活血清解灵治疗后，NTCP含量显著增高，胆汁酸的转运障碍得到了有效缓解。

综上所述，活血清解灵可通过促进胆汁酸的代谢而有效改善肝内胆汁淤积的病理状态。