刘伟昌,马秀丽,刘虎,王洪涛

武威市人民医院,甘肃武威 733000

胃癌是常见的恶性肿瘤，其病死率在恶性肿瘤中居第二位[1]。早期胃癌临床症状不明显，晚期则出现胃区隐痛、幽门梗阻等症状，此时胃癌手术成功率较低，患者病死率较高。亮氨酸拉链EFhand结构域跨膜蛋白1(LETM1)是一种线粒体内膜蛋白，在多种肿瘤细胞中均呈高表达，如乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌等[2]，该蛋白在促进线粒体翻译、调节钙离子及钾离子的运输中有重要意义[3]。文献[4]报道，LETM1还可抑制线粒体的合成功能来诱导宫颈癌Hela细胞的坏死。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是在人或动物体内缺氧时产生的因子，是缺氧诱导因子-1(HIF-1)的一个亚基，是体内氧平衡重要调节因子之一，在介导肿瘤细胞适应微缺氧的环境时发挥重要作用，其在多种肿瘤细胞中均呈阳性表达，如结肠癌、乳腺癌、宫颈癌及胰腺癌等[5]。研究证实，LETM1和HIF-1α在前列腺癌、结肠癌、肺癌中均呈高表达状态，在肿瘤发生发展过程中起到一定促进作用，但两者在胃癌中的作用机制及相关性研究较少。2013年1月～2019年5月，我们应用免疫组化技术检测了胃癌组织及癌旁正常组织中LETM1和HIF-1α的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2014年5月于我院住院治疗的胃癌患者95例，纳入标准：①符合2012版食管癌和胃癌治疗指南中胃癌的诊断标准[6]，均经术后病理检查确诊为胃癌；②均为首次诊断，从未做过放疗或化疗；③患者临床病理资料完整并接受随访，且均通过患者及家属的同意并签署知情同意书。排除标准：①患有其他消化系统疾病，如胃炎、胃溃疡等；②患有其他系统疾病或恶性肿瘤，如食管癌、乳腺癌等；③患有免疫功能缺陷疾病。95例患者中男52例、女43例，年龄39～78(60.31±6.7)岁，≥60岁35例，<60岁60例。胃癌组织病理检查结果显示，组织分化程度(参考第8版美国癌症联合会标准[7])：中低分化58例，高分化37例；浸润深度：T1 20例，T2 25例，T3 32例，T4 18例；组织学分型：肠型38例，弥漫型44例，混合型13例；TNM分期(参考第8版美国癌症联合会标准[7])：Ⅰ期20例，Ⅱ期23例，Ⅲ期38例，Ⅳ期14例；有淋巴结转移66例；肿瘤直径<4.5 cm 36例，≥4.5 cm 59例。自患者出院起，每1～3个月随访1次，包括门诊和电话两种随访方式，随访时间3～60个月，随访至终止时间或患者死亡，随访时间截至2019年5月，收集患者生存数据。本研究通过我院伦理委员会批准。

1.2 胃癌及癌旁正常组织中LETM1和HIF-1α表达检测 采用免疫组化技术(SP法)检测胃癌及癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)中LETM1和HIF-1α表达。将胃癌及癌旁正常组织用甲醛固定后石蜡包埋，切片机切成厚度为3～4 μm的切片，二甲苯脱蜡、无水乙醇水化后PBS缓冲液清洗3次，每次5 min。将切片浸入枸橼酸缓冲液，100 ℃加热10 min后自然冷却，冲洗，3%过氧化氢室温孵育10 min后滴加100 μL LETM1抗体稀释液(稀释比例为1∶100，购自Abnova公司)，HIF-1抗体稀释液(稀释比例3∶800，购自Proteintech公司)，4 ℃过夜后清洗，再滴加100 μL聚合物辅助剂(购自中山金桥公司)，室温孵育20 min。PBS清洗3次后滴加辣根过氧化物酶(购自中山金桥公司)100 μL，同样室温孵育20 min后PBS清洗3次，每次2 min。DAB显色5 min，苏木素复染4 min，流水冲洗后乙醇梯度水化，最后树脂胶封片。显微镜镜检(400×)，选取切片的5个视野，计算5个视野阳性细胞平均百分率，然后根据细胞的染色强度和细胞阳性百分率综合计算分数[8]：未着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；细胞阳性率<10%为0分，>10%～30%为1分，>30%～50%为2分，>50%为3分。根据以上两项结果得分相乘，0～2分视为阴性，≥3分为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；相关性分析使用Spearman相关分析；采用Kaplan-Meier法进行患者预后生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌与癌旁正常组织中LETM1和HIF-1α表达比较 胃癌组织中LETM1主要表达于细胞膜上，经免疫组化技术处理后，呈棕褐色染色，而癌旁正常组织无染色或染色较浅。胃癌组织中LETM1阳性表达率为66.3%(63/95)，癌旁正常组织中LETM1阳性表达率为18.9%(18/95)，二者比较差异有统计学意义(χ2=43.57，P<0.05)。胃癌组织中HIF-1α主要表达于细胞核上，经免疫组化技术处理后，呈棕褐色染色，癌旁正常组织无染色或染色较浅。胃癌组织中HIF-1α阳性表达率为60.0%(57/95)，癌旁正常组织中HIF-1α阳性表达率为17.8%(17/95)，二者比较差异有统计学意义(χ2=35.41，P<0.05)。

2.2 胃癌组织中LETM1和HIF-1α表达的关系 Spearman相关分析结果显示，胃癌组织中LETM1和HIF-1α表达呈正相关(r=0.362，P<0.05)。

2.3 胃癌组织中LETM1、HIF-1α表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组织中LETM1和HIF-1α蛋白表达阳性率与浸润深度、临床TNM分期、组织分化程度及淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤直径及组织学分型无关(P均>0.05)。见表1。

表1 胃癌组织中LETM1、HIF-1α表达与患者临床病理特征的关系(例)

2.4 胃癌组织中LETM1和HIF-1α表达与患者预后的关系 95例胃癌患者均随访成功，无失访病例。随访5年内，共有42例患者死亡，5年总生存率为55.7%。其中，LETM1阳性63例中死亡32例，5年生存率为49.2%；LETM1阴性32例中死亡10例，5年生存率为68.8%。经Log-rank检验，χ2=8.085，P=0.004。HIF-1α阳性57例中死亡29例，5年生存率为49.1%；阴性38例中死亡13例，5年生存率为65.8%。经Log-rank检验，χ2=4.965，P=0.025。

3 讨论

胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，其发病率和病死率远高于全球平均水平[9]。高盐饮食、吸烟、饮酒、幽门螺杆菌(Hp)感染均是罹患胃癌的危险因素[1]。虽然近年胃癌发病率有所下降，手术及放化疗治疗水平不断提高，但胃癌患者生存率并未得到大幅度提升[10]，且预后差，易复发，患者长期生存率低。

LETM1是一种跨膜蛋白，由疏水端-N端、亲水端-C端共同组成，最早发现于一个Wolf-Hirschhorn(WHS综合征)患者，位于染色体4p16.3，相对分子质量为83.4 kD，并参与多种生物学功能[2]，如跨膜转运离子、Ca2+、H+及K+等，因此LETM1可平衡线粒体内外的渗透压，维持线粒体形态，并参与细胞凋亡过程[11]。Doonan等[12]研究发现，下调LETM1表达可引起细胞死亡，减少细胞内线粒体的数量。研究发现，LETM1参与肿瘤细胞的生长及代谢过程，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[13]。本研究中，胃癌组织中LETM1阳性表达率高于癌旁正常组织中，差异有统计学意义。其原因可能为肿瘤组织生长需充足的营养物质及能量，使得肿瘤组织周围小血管数量增多，进一步使得细胞内线粒体的数量增多，因此线粒体内的LETM1表达上调[13]。本研究结果还显示，胃癌组织中LETM1表达与肿瘤浸润深度和转移有关。机制可能为当LETM1高表达时促进β-catenin、Cyclin D1和c-Myc几种原癌基因的转录，进而激活恶性肿瘤进展中重要的信号通路Wnt/β-catenin，刺激肿瘤细胞分裂、增殖，并随着血液、淋巴向周围组织浸润及迁移[14]。相反地，当抑制LETM1表达时，大部分细胞的增殖周期停滞于S期，对细胞生长产生抑制作用，从而抑制肿瘤细胞迁移和增殖。本研究结果显示，胃癌组织中LETM1阳性表达率与肿瘤临床分期、分化程度有关。机制可能为高表达的LETM1使线粒体功能产生障碍，激活糖酵解途径使ATP生成增加，活化了磷酸酶进而激活PI3K/Akt信号通路，促进肿瘤细胞增殖分化，肿瘤临床分期、分化程度增高[15]。

HIF-1α是HIF蛋白家族的主要成员之一，其染色体位置为14q21-24，长度约为3 700 bp。HIF-1α是肿瘤微环境中的重要组成部分，在多种恶性肿瘤中均呈高表达，如胰腺癌、乳腺癌[5]，对肿瘤的发生发展及侵袭有重要影响。本研究结果显示，胃肿瘤组织中HIF-1α表达远高于癌旁正常组织，机制可能是肿瘤组织生长需形成新的血管及充足能量，导致糖酵解途径增加，肿瘤组织处于微缺氧环境中，HIF-1α生成增加，促进肿瘤组织适应微缺氧环境[16]。本研究结果显示，胃癌组织中HIF-1α阳性表达率与肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关。机制可能是HIF-1α使其靶基因血管内皮生长因子(VEGF)表达增加[17]，而VEGF是最有效的肿瘤血管生成因子之一，引起血管内皮细胞增殖、迁移和新血管形成，增加了肿瘤细胞转移及侵袭的机会，进一步促进肿瘤的局部浸润，促进肿瘤的恶性进展。本研究结果显示，胃癌组织中HIF-1α阳性表达率与肿瘤临床分期、组织分化程度有关。其机制可能为HIF-1α激活了Wnt信号通路中的β-catenin和TCF/LEF等蛋白，从而促进了其靶基因的转录，进一步促进肿瘤的增殖、分化，使得肿瘤恶性程度升高[18]。

本研究中LETM1和HIF-1α表达阳性者5年生存率均低于阴性者，说明LETM1和HIF-1α的高表达状态很可能与胃癌患者的预后不良相关，并有可能成为胃癌预后不良的肿瘤标志物。本研究结果还显示，LETM1和HIF-1α表达存在正相关关系，原因可能为LETM1通过影响线粒体的生物学功能使得HIF-1表达增加，诱导肿瘤周围组织小血管增生，为肿瘤生长提供营养物质。因此，LETM1和HIF-1α在肿瘤发生发展过程中发挥协同作用，共同促进肿瘤增殖。

综上所述，胃癌组织中LETM1和HIF-1α表达均升高，二者协同促进胃癌的发生发展；检测二者表达有助于胃癌诊断及病情判断。