吴昊星，刘百红，刘雪微，王 敏，吕艳丽，陈西钊

（1.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100089；2.中国农业大学，北京 100089）

狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒导致的一种人兽共患疾病，又称恐水症[1]。狂犬病病毒属于核糖核酸型弹状病毒，通过唾液传播，多见于犬、狼、猫等食肉动物。狂犬病是世界上病死率最高的疾病，一旦发病，病死率几乎为100%[2-4]。据统计，全球每年约有59 000 人死于狂犬病，其中95%的患者来自亚洲、非洲等发展中国家。造成这一严重状况的主要原因是较高的疫苗成本和患病动物难以控制等[5]。近年来，我国狂犬病发病和死亡人数呈上升趋势，自2003年以来，年发病例数均超过2 000 例。疫苗免疫是预防狂犬病的主要措施之一。而免疫效果的好坏，需要相应的技术方法对其进行评估和监测。本研究对一种基于荧光层析技术的狂犬病病毒抗体检测方法进行了临床应用，旨在评价该纳米荧光试纸条的性能。

1 材料和方法

1.1 材料

狂犬病病毒纳米荧光抗体试纸条，来源于实验室自制；AFS-1000 荧光分析仪，购自广州蓝勃公司；犬狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒与犬细小病毒五联活疫苗（批号20170607-1），购自吉林省五星动物保健药厂；犬猫狂犬病病毒抗体检测试剂盒（批号17ZEAW002），购自法国SYNBIOTICS公司；狂犬病病毒抗体ELISA 试剂盒（批号RV20181029E），购自北京世纪元亨公司。

1.2 检测样本

A 组：37 份未免疫狂犬病疫苗的犬血清；B 组：36 份免疫狂犬病疫苗后1个月的犬血清；C 组：36 份免疫狂犬疫苗后2个月的犬血清。A、B、C 3 组犬血清，由中国农业大学馈赠；免疫疫苗，为吉林五星动物保健厂生产的犬狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒与犬细小病毒五联活疫苗；122 份临床犬血清，来自合作养犬基地。

1.3 检测与结果判定

将采集的A、B、C 3 组犬血清样本，按照狂犬病病毒纳米荧光抗体检测试纸条说明书进行检测，记录结果。试纸条临界值（Cut-off）为0.5，大于0.5 为狂犬病病毒抗体阳性，反之为阴性。采用试纸条、SYNBIOTICS 试剂盒、北京世纪元亨试剂盒，同时检测122 份临床犬血清。

1.4 数据分析

根据记录的检测结果，分析3 组犬血清样本的狂犬病病毒抗体变化；利用SPSS 25 软件计算试纸条、SYNBIOTICS 试剂盒、北京世纪元亨试剂盒的符合率及Kappa 值。

2 结果与分析

2.1 3 组犬血清抗体检测

从A、B、C 3 组犬血清的检测结果（图1）可以看出：未免疫狂犬病疫苗的A 组整体抗体水平极低，免疫狂犬病疫苗1个月后的B 组抗体水平迅速升高，免疫2个月后的C 组抗体水平出现回落，与犬血清中的狂犬病病毒免疫抗体变化规律[6]完全相符。

图1 A、B、C 3 组犬血清的狂犬病病毒抗体检测结果

2.2 临床犬血清检测

试纸条与SYNBIOTICS 试剂盒的临床犬血清检测结果（表1）显示，两者阳性符合率为92%，阴性符合率为91.67%，总符合率为90.17%。经SPSS 25 统计分析，Kappa 值为0.832。试纸条与北京世纪元亨ELISA 试剂盒的检测结果（表2）显示，两者阳性符合率为96.16%，阴性符合率为97.15%，总符合率为96.73%。经SPSS 25 统计分析，Kappa 值为0.933。

表1 试纸条与SYNBIOTICS 试剂盒符合率试验 单位：份

表2 试纸条与北京世纪元亨ELISA 试剂盒符合率试验 单位：份

3 讨论

狂犬病是一种病死率极高的人兽共患自然疫源性疾病。目前尚无有效治疗药物，注射狂犬病疫苗是目前预防狂犬病的有效措施之一。市场上的狂犬病病毒抗体检测试剂盒较多，技术方法目前主要集中在酶联免疫吸附试验（ELISA）和胶体金免疫层析试验（GIA）。张德宝等[7]以灭活纯化的狂犬病病毒SRV9 株为包被抗原，制备了5 批次狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒与FAVN法、商品化进口试剂盒相比，总符合率分别为90.80%和94.25%，敏感性较高。本研究临床应用的试纸条是一种基于免疫层析技术和纳米荧光微球标记技术的诊断方法。采用该试纸条检测未免疫和免疫后不同时间的犬血清样本，发现检测结果与免疫抗体变化规律完全相符。临床犬血清检测结果显示，该试纸条与法国SYBIOTICS 试剂盒、北京世纪元亨ELISA 试剂盒一致性良好，符合率均在90%以上。临床应用结果表明，该试纸条可用于犬血清的抗体检测，而且能够量化检测结果并快速检测样本，从而弥补了ELISA 方法时效性差和GIA 方法靠肉眼观察无法量化结果的缺点，便于检测人员快速准确检测狂犬病病毒抗体。

从巴斯德开创兔脑脊髓组织狂犬病疫苗到现在，狂犬病病毒已发展了5 代：早期为神经组织来源疫苗，第2 代为禽胚培养疫苗，第3 代为细胞培养疫苗，第4 代为亚单位疫苗及精制疫苗，第5 代为正在发展的新一代基因工程疫苗[8]。弱毒疫苗使用的毒株包括SAG1、ERA、Flury 株等。由于弱毒疫苗存在一定的安全隐患，WHO 提倡使用灭活疫苗来代替弱毒疫苗。灭活疫苗使用的毒株包括PM、Flury、CTN、aG 株等[9]。本试验免疫疫苗为“五联苗”，其中狂犬病病毒疫苗株为CVS-11 株，对其他疫苗株未进行免疫试验。下一步，需利用该试纸条对不同疫苗株进行免疫效果评价，与其他商品试剂盒对不一致样本通过中和试验进行对比验证，进一步探究该试纸条的临床检测效果。

4 结论

该研制的狂犬病病毒抗体纳米荧光检测试纸条可以真实反映不同免疫阶段的狂犬病病毒抗体变化，与法国SYBIOTICS 公司的犬猫狂犬病病毒抗体检测试剂盒、北京世纪元亨公司的狂犬病毒抗体ELISA试剂盒一致性良好，可应用于临床中狂犬病疫苗的免疫效果评估，指导临床建立合理的免疫策略。