武鑫，孙宁宁，王冬慧，张松江，高剑峰

(1.河南中医药大学基础医学院，郑州 450046;2.河南中医药大学研究生院，郑州 450046)

前期实验研究表明采用 X射线照射实验小鼠后，可造成小鼠新物体认知能力的损伤，表现为在旷场实验中放射线照射小鼠垂直及水平运动时间、修饰次数较对照组小鼠均显著减少，而在新物体认知实验中放射线照射小鼠在两个检测时间点对新物体探索时间及认知指数均明显下降[1]。不同疗程电针干预可抑制海马区神经元的凋亡，一定程度逆转上述由放射线照射所导致的认知功能损伤[2]。已有研究表明在中枢神经系统中海马区是对放射线照射最敏感的核团，X射线照射可产生大量的自由基，严重损伤该区域神经元的形态功能以及突触传递功能，最终引起脑组织退行性病变[3-4]。在中枢神经系统，神经元通过形成功能性的突触相互联系，构成神经回路发挥功能。突触可塑性是指突触在数量、形态和功能上有序地发生变化，是大脑学习记忆功能的分子生物学基础[5]。因此，本实验在前期实验结果基础之上，探讨电针干预对放射线照射小鼠海马区依赖性空间学习记忆功能以及突触结构功能的作用及影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

40只健康清洁级C57BL/6J小鼠，雄性，1月龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物合格证号11400700063049)。将小鼠置于 7:00—19:00光照和19:00—7:00黑暗的实验室，食水不限。按随机数字表法将小鼠分为对照组10只、放射线照射组(8 Gy)10只、电针穴位组10只、电针非穴位组10只。

1.2 主要仪器与试剂

全自动Morris Water Maze(淮北正华生物仪器设备有限公司);直线加速器(Varian Clinac 600 CD，Radiation Oncology Systems，SanDiego，CA，USA);电针仪(上海华谊医用仪器有限公司，G6805-2A);石蜡切片机(Leica，型号 2235);体视学显微镜(Leica，型号 M205FA);投射显微镜(日立，型号 H-7500);图像分析系统Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA，型号 41N5100-44800);低温高速离心机(日立，CF6RXⅡ);核酸定量仪(岛津，Biospec-nano);生物分子成像仪(富士，LAS-4000MINI);凝胶成像仪(Bio-Rad);syanpsin 1抗体(Abcam，ab64581);β-actin抗体(Abcam);HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB-2301)，PageRμl er™ Prestained Protein Ladder(Fermentas，SM0671)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(北京赛驰生物科技有限公司，300000-B)，eECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0049)。

1.3 实验方法

1.3.1 X射线照射方法[1]

雄性 C57BL/6J小鼠腹腔注射 2%戊巴比妥钠(0.1 mL/10 g)麻醉，将动物俯卧位固定于放射平台，左侧大脑半球照射范围 1 cm×2 cm，射线源距离脑99.5 cm，照射剂量为8 Gy，剂量率为400 cGy/min，照射过程约持续10 min，采用PRIMUS型高能医用电子直线加速器X射线进行照射。用铅模覆盖避免呼吸肌消化道系统损伤，照射完成后将动物送回鼠笼，电针穴位组和电针非穴位组第2天开始给予电针干预。

1.3.2 电针干预

电针方法参考发表文献[6]，电针穴位组取百会(顶骨正中)、风府(枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处，双侧肾俞(第2腰椎后两旁凹陷处)，用无菌针灸针(苏州医疗用品厂，0.30 mm×13 mm)向后斜刺入，深度约1 mm，连接电针仪，百会、风府接1组，双侧肾俞接1组，参考文献[7]设置刺激参数，电压1.5 V，频率10 Hz，波宽1 ms，电针时间每次30 min，每日1次，连续电针干预3周。电针非穴位组取尾根前 0.5 cm，后背正中线旁开0.3 cm;尾根前1.0 cm，后背正中线旁开0.3 cm，电针方法和疗程同电针穴位组。

1.3.3 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验参考发表文献[8]。水迷宫仪器为一直径160 cm、高50 cm的圆形水池，内壁为黑色，池内水深30 cm，水温为(22±2)℃，实验室内光线恒定，水池周围为竖起的不透光围帘，保证无光线直射入水池内。水池壁上的4个等距离点将水池分为4个象限，并将第 3象限设为靶象限，在第 3象限距离池壁约40 cm处放置一直径为 10 cm的透明平台，高 28 cm，位于水面下2 cm处。水迷宫上方安置有摄像机，与电脑主机相连，同步记录各组小鼠运行轨迹。定位航行实验将各组小鼠连续训练5 d，每日1次。具体训练方法为将各组受试小鼠按顺时针方向依次由 E、S、W、N入水点放入水中，并记录小鼠在2 min内从寻找到水下平台所需的时间(即潜伏期)。如果小鼠在2 min内未找到平台，则由实验人员将其引至平台上并停留10 s，然后将其送回鼠笼中。在定位航行实验结束后，进行空间探索实验，将目的象限的平台撤去，从同一入水点将各组小鼠放入水中，并记录其在2 min内在原平台所在象限停留时间以及穿越原平台所在象限次数。

1.3.4 透射电镜检测突触超微结构

取固定的海马组织样品PBS漂洗4次，每次10 min，然后进行1%锇酸后固定1.5 h，PBS漂洗，脱水处理按30%→50%→70%(过夜)→90%→100%Ⅰ丙酮浓度脱水，再次浸入100%Ⅱ、Ⅲ丙酮各45 min，然后环氧树脂812添加 4 h后聚合包埋，反应条件为 37℃ 12 h→45℃12 h→60℃ 24～48 h。待包埋组织完全聚合完毕后进行修整切片，切片厚度为 70 nm。超薄切片进行染色，染色方法为柠檬酸铅5 min→醋酸双氧铀25 min。透射电镜观察并进行拍照，每组选取3只小鼠，每只小鼠选取 5个海马切片观察海马区突触数量及结构，统计突触间隙及突触后致密物厚度。

1.3.5 突触蛋白-1 mRNA表达检测

突触蛋白-1基因表达RT-qPCR检测，取各组小鼠海马区新鲜组织置于液氮3 h，然后移入﹣80℃冰箱备用。利用RNA提取试剂盒提取总RNA，用紫外线分光光度计测定260 nm/286 nm吸光度比值及琼脂糖电泳鉴定其纯度。RT-qPCR方法，采用Prime Premier 5.0设计 引 物 ，synapsin-1(正 义 链 为5’-ATCCTCTCCTGGAGCTCTGA-3’， 反 义 链 为5’-GGGCTTCTTATGGAATTGGA-3’，95℃ 预 变 性1 min，95℃变性 15 s，60℃退火 1 min)。内参基因β-actin(正义链为 5’CAGGCATTGCTGACAGGATG-3’，反义链为3’-TGCTGATCCACATCTGCTGG-5’)。PCR产物用含 0.5 μg/mL溴乙啶的 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，LAS1000 CCD曝光系统进行检测。突触蛋白-1表达Western blot检测取﹣80℃保存的小鼠海马区脑组织(约 50 mg)放入预冷号的研钵中加入液氮研磨成粉末状。

1.3.6 突触蛋白-1蛋白表达检测

常规组织蛋白质提取，将标本加入等量 3×SDSPAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)缓冲液，96℃加热 5 min，样本采用4%～20%的Tris-Glycine胶电泳90 min分离蛋白，然后转移至硝基纤维膜。硝基纤维膜采用含5%脱脂牛奶的 TBST-T(30 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20)室温振荡封闭1 h，然后用 1×TBST-T反复洗涤后与 synapsin-1一抗(1:500稀释)室温4℃过夜孵育。取出膜用TBST4次，每次 5 min，漂洗过后与过氧化物酶标记的二抗(1:1000稀释)室温振荡孵育1 h，TBST洗涤后在显色底物液(Pierce，Rockford，IL)中显色 5 min，采用 LAS1000 CCD曝光系统检测特异性条带，并以β-actin为内参蛋白对样品条带进行半定量。

1.4 统计学方法

实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。符合正态分布的数据均以均数±标准差表示。水迷宫实验结果采用重复测量方差分析结合Tukey’s multiple comparisons test检验，分子生物学实验结果采用单因素方差分析结合Tukey’s multiple comparisons test检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针干预对放射线照射小鼠空间学习记忆功能的影响

水迷宫实验表明，与对照组比较，放射线照射组小鼠潜伏期呈现显著增加的趋势，其中在第 2天至第 5天两组差异具有统计学意义(第2天P＜0.05，第3天P＜0.05，第4天P＜0.01，第5天P＜0.01)。而与放射线照射组比较，电针穴位组则在第3天(P＜0.01)、第4天(P＜0.01)以及第5天(P＜0.01)寻找平台潜伏期显著缩短。此外，放射线照射组与电针非穴位组之间没有明显差异(P＞0.05)。空间探索实验结果表明放射线照射组小鼠在穿越平台所在目的象限次数以及在目的象限停留时间均较对照组显著降低(P＜0.01)。而电针穴位干预后小鼠的上述两项指标均显著增加，并且与放射线照射组比较具有显著性差异(P＜0.05)，电针非穴位组则没有上述影响。结果见图1。

图1 电针干预对小鼠寻找平台潜伏期及空间探索能力的影响

2.2 电针干预对放射线照射小鼠海马区突触结构的影响

行为学实验表明电针干预可一定程度改善放射线照射所致的学习记忆能力的损伤，而海马区突触功能是学习记忆的分子学结构基础，因此检测了各组小鼠海马区突触结构的改变。在同一倍数下观察各组小鼠海马区可见，对照组突触数量最多，结构明确且完整，突触间隙清晰。而放射线照射组突触间隙不清晰，结构不完整，电针穴位组较放射线照射组有所改善，突触结构明确，间隙较为清晰。实验结果表明与对照组比较，放射线照射组小鼠海马区突触间隙及突触后致密区厚度均发生了明显变化，如图中矩形标示突触间隙显著减小(P＜0.05)，如图中箭头标示突触后致密区厚度也显著减小(P＜0.01)。而与放射线照射组比较，电针穴位组小鼠海马区突触间隙增加(P＜0.05)，突触后致密区厚度也显著增加(P＜0.05)。电针非穴位组不具有上述影响作用，变化不明显。结果见图2。

图2 电针干预对小鼠海马区突触结构的影响

2.3 电针干预对放射线照射小鼠海马区突触蛋白-1表达的影响

进一步从基因与功能蛋白表达两个水平检测了海马区与突触传递效应密切相关的功能蛋白突触蛋白-1的表达变化。实验结果表明，与对照组比较，放射线照射组小鼠海马区突触蛋白-1基因表达显著下降(P＜0.05)，而电针干预后该基因表达则显著升高(P＜0.01)。实验结果还显示海马区突触蛋白-1蛋白表达趋势与基因表达实验结果一致。与对照组比较，放射线照射组小鼠海马区突触蛋白-1蛋白表达水平均显著下降(P＜0.01)，而电针穴位干预后小鼠海马区突触蛋白-1蛋白表达水平较放射线照射组显著增加(P＜0.05)，电针非穴位组则没有上述变化。结果见图3。

图3 电针干预对小鼠海马区突触蛋白-1表达的影响

4 讨论

学习记忆是大脑的高级功能之一，所涉及的脑区复杂，并且与不同脑区的蛋白分子变化密切相关。其中海马区是公认的与学习记忆过程密切相关的功能脑区[9-11]。海马区突触结构及功能的损伤会影响新事物学习及记忆过程[12]。前期实验结果发现放射线照射可显著损伤小鼠新物体认知功能，给予电针穴位干预则一定程度改善了上述损伤作用。Morris水迷宫是广泛应用于学习记忆功能评价的经典行为学实验方法[13-14]，可以较为客观地评价实验对象的空间学习和记忆能力[15-16]。本实验结果显示在水迷宫实验中放射线照射组小鼠寻找平台潜伏期显著增加，穿越平台所在目的象限次数和在目的象限停留时间显著减少，而给予电针穴位干预可使小鼠寻找平台潜伏期显著缩短，穿越平台所在目的象限次数增加，在目的象限停留时间延长。电针非穴位组则没有上述影响。上述行为学结果说明电针穴位有效地促进了放射线照射小鼠空间学习记忆功能。

在中枢神经系统中，神经元之间通过形成功能结构——突触相互联系构成神经回路。到目前为止，大量研究认为学习记忆的获得、储存与再提取需要突触在数量结构以及功能上发生改变，这种有序的变化被称为突触可塑性[17-18]。突触可塑性被公认为是学习记忆功能的神经生物学基础[19]。而临床上一些与认知功能、学习记忆功能损伤相关的神经系统疾病均与突触病理性改变密切相关[20-21]。边缘系统是调节学习记忆功能的核心脑区[海马区作为边缘系统的重要组成部分，位于颞叶内腹侧]，由海马和齿状回两部分组成，被公认为与空间学习记忆功能密切相关[22]。海马区突触功能损伤会影响整体行为学的改变，研究报道海马损伤后小鼠短期记忆丢失并且无法形成新的记忆[23]。突触蛋白-1 (synapsin-1)是一种与突触结构功能密切相关的功能蛋白质，参与调节突触囊泡的移动，突触前膜神经递质的释放等。有研究表明早期给予麻醉剂可减少突触蛋白-1的表达，干扰突触结构发育并导致认知功能损伤[24]。因此，突触蛋白-1通过调控突触前传递的效应在突触可塑性中发挥了重要的作用。有研究表明电针具有促进神经递质释放，改善突触超微结构，调节突触可塑性等功能[25]。突触后致密物质(postsynaptic density，PSD)是指突触后膜内侧一层分布均匀的致密物质，其中包括有可与突触前释放的神经递质结合的受体、蛋白信号分子以及细胞骨架蛋白等[26]。有研究表明PSD蛋白可通过调节突触后谷氨酸受体的动力学变化在突触功能以及可塑性过程中发挥生理及病理学作用[27]。本实验水迷宫实验明确电针穴位改善了放射线照射小鼠空间学习记忆功能，进一步实验发现放射线照射组小鼠海马区突触结构和间隙均出现明显损伤，突触间隙减小，PSD厚度下降，而电针穴位组小鼠海马区突触结构较明确，突触间隙清晰，突触间隙以及PSD厚度较放射线照射组均显著增加。此外，分子生物学实验结果显示放射线照射组小鼠海马区突触蛋白-1基因及蛋白表达均较对照组显著下降，而给予电针穴位干预则显著提高了突触蛋白-1的表达。上述实验结果说明电针穴位可通过上调海马区突触蛋白-1的表达改善放射线照射小鼠突触结构以及功能，增强突触的可塑性，从而在整体水平增强了小鼠的空间学习记忆功能。

本研究利用整体行为学以及分子生物学方法探讨了电针穴位对放射线照射所导致的学习记忆功能损伤的影响，并进一步检测了与学习记忆密切相关的海马区突触结构及关键突触蛋白的作用，结果表明电针穴位改善了放射线照射小鼠空间学习记忆行为损伤，这一影响作用与突触结构改变以及突触蛋白-1表达水平上调密切相关，说明电针穴位的改善作用机制与突触可塑性有关，具体蛋白信号通路需进一步实验探明。