张静 陈曦 王彬 付雷 陆宇 陈效友

结核病是一种严重威胁人类健康的传染性疾病，2019年WHO[1]报告估算2018年全球约1000万例新发结核病患者，全球平均结核病发病率为130/10万，因结核病而死亡患者约为145.1万例，耐多药结核病(MDR-TB)的治愈率约为56%。面对严重的结核病疫情，亟需发现新的有效抗结核药物。体外抗结核药物活性测定是新药药效学评价的重要环节，传统平板计数法[2]，耗时长，现已较少应用；而目前国内外常用快速检测最低抑菌浓度(MIC)的方法包括微孔板Alarmar blue(MABA)法[3]、刃天青微孔板稀释(REMA)法和四唑染料 (tetrazolium dye)法等；因结核分枝杆菌生长缓慢，上述检测方法需要7～9 d才能获得结果。因此，需要建立一种快速、有效的药物活性检测方法，以满足抗结核新药开发的需要。

单叠氮乙醚(ethidium monoazide, EMA)或单叠氮丙啶(propidium monoazide, PMA；本研究使用PMA改良类似物PMAxx)[4]是一种核酸染料，它可以通过受损的细胞膜，在暴露于强可见光后共价插入细菌基因组，形成不可逆结合而干扰DNA扩增；利用EMA/PMA对受损与未受损的细菌进行预处理并联合荧光定量PCR(qPCR)检测，根据被降低或完全抑制的PCR信号来有效鉴别活菌和死菌。尽管PMA特异性渗透及抑制DNA扩增的机制尚不明确，但该方法已广泛应用于检测食品或复杂环境条件下的活菌[4]、寄生虫[5]，以及相关的水质鉴定[6]。但是，该方法针对结核分枝杆菌的研究相对较少，尚未见到直接应用于抗结核药物活性检测的报道。

本研究首先通过未经处理和热灭活的结核分枝杆菌来建立PMAxx-qPCR的检测方法，并将该方法直接应用于一线抗结核药物异烟肼(INH)和利福平(RFP)体外活性测定，并且与传统检测方法相比较，以有效评估PMAxx-qPCR方法的适用性。

资料和方法

一、结核分枝杆菌标准株

结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC27294)为北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室保存菌。

二、主要试剂和仪器

1.试剂：PMAxx(40069，美国Biotium公司)；Middle brook 7H9培养基(271310，美国BD公司)；Middle brook 7H10培养基(262710，美国BD公司)；Middle brook OADC增菌液(由氯化钠、牛血清白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶、油酸组成)(212351，美国BD公司)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(P1022，北京索莱宝科技有限公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(219605580，美国Mp Bio公司)；Flash Hot Start Master Mix (SJ22e06351081，北京康为世纪生物科技有限公司)；Eva-Green qPCR Master Mix(31000，美国Biotium 公司)；吐温80(9005-65-6，北京索莱宝科技有限公司)；西班牙琼脂糖(9012-36-6，北京索莱宝科技有限公司)。

2.仪器：多功能酶标仪(型号：Infinite M200pro, 瑞士迪肯公司)；电热水浴锅(型号：WBK-3B，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；PMA-Lite LED光解仪(型号：E90002，美国Biotium公司)；荧光定量PCR仪(StepOnePlus, 美国应用生物系统公司); PCR仪(型号：Genepro，杭州博日科技有限公司)；高速离心机(型号：1730R，中国香港基因有限公司)。

三、实验方法

(一)菌液制备

1.标准株培养：结核分枝杆菌H37Rv标准菌株接种于含10% OADC和0.05% 吐温 80的7H9 液体培养基，置37 ℃恒温箱内培养至对数生长期，于酶标仪中在570 nm处测定吸光度值(A值)[7]，以A值0.1=1×108菌落形成单位(CFU)/ml为标准，配制成终浓度为1×108CFU/ml的活菌悬液，备用。

2.热灭活菌：取500 μl活菌(浓度：1×108CFU/ml)悬液于水浴锅进行热处理(100 ℃，30 min)，冷却至室温，制成热灭活菌，备用。

(二)PMAxx处理条件优化

1.条件设置：曝光时间为10、15、20和30 min；暗孵育时间为10、30和60 min；PMAxx终浓度为5、10、20、40、80和100 μmol/L。

2.处理流程：将PMAxx(浓度分别为：5、10、20、40、80和100 μmol/L)分别加入含500 μl活菌或热灭活菌(终浓度：107CFU/ml)的透光离心管中，37 ℃恒温箱内避光孵育(时间分别为：10、30和60 min)，室温下于PMA-Lite LED光解仪(波长λ=465～475 nm，60 W)中进行曝光(时间分别为：10、15、20和30 min)，混悬液经25 000×g离心5 min，后经PBS洗涤2次，弃去上清液，取沉淀重悬于200 μl 双蒸水(ddH2O)中。

3.DNA模板制备：将重悬液于沸水中水浴加热30 min，15 520×g离心3 min，取上清液作DNA模板，备用。

4.qPCR检测：反应体系为10 μl 2×Eva-Green qPCR Master Mix、2 μl ROX校正染料(10 mg/ml)、0.5 μl 40×模板缓冲体系、rrs4正反向引物各0.3 μl(表1)、1 μl DNA模板和5.9 μl ddH2O。反应程序(2步法qPCR[8])为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火及延伸30 s(采集荧光信号)；每次PCR反应重复40个循环进行。记录循环阈值(quantification cycle, Cq值)。

(三)PMAxx处理的相关影响因素

1.标识靶基因片段长度的影响: 基于NCBI中提供的结核分枝杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer Express 3.0.1软件自行设计PCR的引物(rrs1～3和rrs5～7)，其中rrs4引物序列引自相关的参考文献[9]。并对基因库中的序列进行BLAST搜索，以评估所有引物的特异性，引物具体信息见表1，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

常规PCR反应体系：5 μl DNA模板、25 μl的2×Flash Hot Start Master Mix和正反向引物各2.5 μl，并使用 ddH2O配平终体系至50 μl。反应条件为95 ℃持续3 min预变性，95 ℃ 30 s变性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 10 s延伸，共30个循环，最后一次循环72 ℃延伸 10 min。经琼脂糖凝胶电泳检验扩增产物，比较进行和未进行PMAxx预处理的细菌样本PCR扩增产物的差异。

2. 结核分枝杆菌生长周期：取同株等浓度的H37Rv活菌悬液分别培养2、3和4周。PMAxx处理组设为实验组，以未进行PMAxx预处理的细菌样本为对照组。两组分别进行qPCR检测，比较实验组和对照组间Cq值差异。

(四)抗结核药物活性检测

1.抗菌药物：选用常见的一线抗结核药物INH(批号：#MKBV9475V)和RFP(批号：#BCBP4553V)，均购自美国Sigma公司；INH使用ddH2O溶解(储备液浓度：1 mg/ml)，RFP使用DMSO溶解(储备液浓度：1 mg/ml)，-20 ℃保存，备用。

表1 不同长度标识靶基因片段引物设计

注F=forward(正向)；R=reverse(反向)

2.抗结核药物活性测定：具体介绍如下。

1)采用PMAxx-qPCR法测算MIC：分别取INH、RFP药物储备液经2倍系列稀释至合适浓度(0.003125、0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 μg/ml)，分别加入200 μl标准株菌液(终浓度为107CFU/ml)，在含5% CO237 ℃恒温箱内培养，分别与INH、RFP作用3、5、7和10 d后取混悬液样本应用优化后的PMAxx-qPCR方法检测。计算抑菌活性公式：抑菌活性=(1-2-ΔCq)×100%，ΔCq=Cq含药-Cq不含药(每次计算对应3个独立样本的DNA提取和qPCR扩增)。绘制量效曲线[药物浓度(μg/ml)/抑菌活性(%)]，加权法计算药物MIC。

2) MABA法检测药物MIC：(1)将96孔酶标板首行的1～6孔设置为7H9培养基对照(200 μl/孔)，7～12孔设为菌对照孔[(100 μl 7H9液体培养基+100 μl菌液)/孔]。(2)在其他行的首孔分别加入200 μl含有单药的7H9培养基混合液(INH、RFP)，均经2倍梯度稀释至如下浓度：0.019、0.039、0.078、0.1562、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和 10 μg/ml，在除对照孔之外的各孔中加入100 μl H37Rv标准株菌液(浓度：106CFU/ml)。(3)在含5% CO237 ℃恒温箱中孵育，7 d后向各孔加入20 μl Alamar blue和12.5 μl 20%吐温80的混合液，再置回37 ℃恒温箱内孵育。(4)24 h后将酶标板置于酶标仪于激发波长为530 nm且发射波长为590 nm条件下，测定各孔的相对荧光强度值，并计算MIC。

3) PMAxx-qPCR法测算药物抗菌计数：将500 μl 标准株菌液(终浓度为107CFU/ml)与一定量的INH、RFP混合，各药物终浓度设定：16×MIC，8×MIC，4×MIC，2×MIC，1×MIC(MIC单位为μg/ml)，以不含药空白孔为阴性对照孔，于含5% CO237 ℃恒温箱内培养10 d，PMAxx-qPCR检测方法同前。取1×108CFU/ml结核分枝杆菌培养液进行连续10倍稀释，获得108CFU/ml至102CFU/ml 7个浓度梯度，经PMAxx预处理后提取DNA，进行qPCR检测，以ddH2O为阴性对照，确定PMAxx-qPCR方法检测敏感度。经线性回归获得标准曲线方程式[Cq值/(lg CFU/ml)]，药物抗菌计数为含或不含药条件下lg CFU/ml差值，并将该结果与同条件下CFU计数方法结果相比较。

4)CFU计数：菌液药物浓度设置同前，吸取200 μl药物作用10 d后混悬液用生理盐水进行连续10倍稀释，均匀涂抹在7H10固态培养基上，在37 ℃恒温箱内孵育3～4周后进行菌落计数。

四、统计学处理

结 果

一、 PMAxx处理的优化条件

1. PMAxx曝光时间：使用PMAxx对活菌进行预处理时，与对照组(未经PMAxx处理)比较，曝光10、15和20 min时Cq值无明显变化，而曝光30 min 时Cq值明显升高(q=8.975，P<0.05)(表2)，提示曝光时间过长可抑制活菌的扩增；使用PMAxx对等量热灭活菌预处理时，各处理组较对照组间差异均有统计学意义，提示使用PMAxx处理可抑制热灭活菌的扩增，但曝光10 min时，热灭活菌Cq值小于其他时间组(P值均<0.05)，提示曝光10 min混悬液中仍存在未与PMAxx结合的游离DNA引起扩增，而曝光15、20和30 min时，各组间Cq值不再随着曝光时间的延长而发生变化(P值均>0.05)(表2)。综合死菌和活菌的结果，以不影响活菌扩增且充分反映死菌的差异为原则，选择15 min作为最佳曝光时间。

2. PMAxx暗孵育时间： PMAxx预处理活菌暗孵育10和30 min与对照组比较差异均无统计学意义，而暗孵育60 min后Cq值出现轻度升高(q=3.991，P=0.006)；同时，经PMAxx处理的热灭活菌各组检测的Cq值较对照组结果明显升高(P<0.001)，且各时间组间两两比较，Cq值不随孵育时间的延长而发生变化(P值均>0.05)，提示10 min即可满足PMAxx预处理孵育要求(表3)。

3. PMAxx最适浓度：PMAxx浓度对活菌和热灭活菌qPCR检测的影响如图1所示，随着PMAxx处理浓度的增加，活菌悬液Cq值总体上有升高趋势，以未经PMAxx预处理菌样本为阴性对照，当PMAxx浓度升高至80 μmol/L 及以上时，活菌扩增Cq值明显增大(26.844±0.376 与 31.625±0.890，t=12.300，P<0.001)，说明高浓度的PMAxx将抑制活菌DNA扩增，且浓度越高抑制效果越明显，因此，不影响活菌扩增的适宜浓度范围为5～40 μmol/L。当PMAxx浓度为5 μmol/L时，PMAxx处理的热灭活菌较阴性对照Cq值无明显变化(27.767±0.244与26.830±0.123，t=2.410，P=0.387)，说明该浓度下无法抑制样品中DNA的扩增；当PMAxx浓度≥10 μmol/L时，Cq值明显升高且各组间差异均无统计学意义(图1)。

表2 曝光时间对PMAxx-qPCR方法鉴定活菌和热灭活菌的影响

注Cq值：循环阈值。各项数据间比较采用单因素方差分析的Tukey多重检验。a: 对照组与曝光10 min的比较；b: 对照组与曝光15 min的比较;c: 对照组与曝光20 min的比较；d：对照组与曝光30 min的比较;e: 曝光10 min与曝光15 min的比较;f: 曝光10 min与曝光20 min的比较;g: 曝光10 min 与曝光30 min的比较:h: 曝光15 min与曝光20 min的比较;i: 曝光15 min与曝光30 min的比较；j: 曝光20 min与曝光30 min的比较；“-”：空白

表3 暗孵育时间对PMAxx-qPCR方法鉴定活菌和热灭活菌的影响

注Cq值：循环阈值。各项数据间比较采用单因素方差分析的Tukey多重检验。a: 对照组与暗孵育10 min的比较；b: 对照组与暗孵育30 min的比较;c: 对照组与暗孵育60 min的比较；d：暗孵育10 min与暗孵育30 min的比较;e：暗孵育10 min与暗孵育60 min的比较;f：暗孵育10 min 与暗孵育60 min的比较。“-”：空白

Cq值：循环阈值；“┰”表示标准差图1 不同PMAxx浓度对活菌和热灭活菌qPCR检测的影响

“-”表示未经PMAxx预处理，“+”表示经PMAxx预处理。M：Marker(2000 bp)；标记编号1～7分别代表rrs1(81 bp)、rrs2(117 bp)、rrs3(143 bp)、rrs4(206 bp)、rrs5(279 bp)、rrs6(316 bp)、rrs7(433 bp)各扩增产物条带图2 不同扩增片段长度对PMAxx-qPCR方法检测的影响

综合比较各组间死活菌ΔCq，发现10 μmol/L 组ΔCq值明显高于其他组(6.772±0.453)。故选择10 μmol/L作为PMAxx鉴别结核分枝杆菌死活菌的处理浓度。

二、PMAxx-qPCR方法相关影响因素

1. 扩增片段长度：电泳图谱显示所有未进行PMAxx预处理的样品均出现明亮单一条带，而随着靶标片段大小变化，PMAxx处理组电泳条带出现明显差异。当扩增片段长度为81～143 bp时，PMAxx处理组仍存在较明显条带；当扩增片段长度为206～433 bp时，处理组电泳条带消失，表示经PMAxx处理的样品DNA扩增被完全抑制(图2)。

2. 结核分枝杆菌的生长周期：随着培养时间的延长，PMAxx处理组与未处理组间ΔCq值逐渐升高，从对数生长期(2周)的0.575个循环升至平台抑制期(4周)的2.866个循环，且当培养时间为3周和4周时，PMAxx处理组较未处理组Cq值差异均有统计学意义，提示不同生长周期的结核分枝杆菌将导致PMAxx检测活菌的背景值存在差异(表4)。

三、 PMAxx-qPCR方法检测抗结核药物的活性

1. 与MABA法比较测定药物MIC：根据PMAxx-qPCR法检测获得的量效曲线(图3，4)进行择点加权测算，得到INH的MIC为0.06 μg/ml(0.049～0.076 μg/ml)，与MABA法(0.032～0.064 μg/ml，t=0.782，P=0.491)一致性良好；而RFP由PMAxx-qPCR方法测算的MIC为0.121 μg/ml(0.102～0.145 μg/ml)，与MABA法(0.051～0.079 μg/ml，t=2.828，P=0.066)一致性尚可；实验结果0.5～2倍MIC值视为可接受范围。同时，对比药物作用5、7和10 d 的量效曲线，发现采用PMAxx-qPCR法在作用后第3天即可测算出药物的MIC。

表4 PMAxx处理前后qPCR所测循环阈值(Cq值)在不同生长周期结核分枝杆菌中的比较

虚线表示抑菌率达到90%最低抑菌浓度；“┰”表示标准差 虚线表示抑菌率达到90%最低抑菌浓度；“┰”表示标准差图3 INH量效曲线(PMAxx-qPCR法) 图4 RFP量效曲线(PMAxx-qPCR法)

2. 与CFU计数法比较药物抗菌活性：定量(终浓度为108CFU/ml)结核分枝杆菌悬液连续10倍梯度稀释，经PMAxx处理后分别提取DNA，经qPCR检测以获得标准曲线[Cq值/(lg CFU/ml)]，其线性回归方程为y=-2.566x+45.51，R2=0.9863(图5)。最低检测限为102CFU/ml(Cq=39.616±0.317)。

Cq值：循环阈值；CFU：菌落形成单位；“┰”表示标准差图5 结核分枝杆菌PMAxx-qPCR标准曲线

根据方程分别计算各浓度(16×MIC，8×MIC，4×MIC，2×MIC，1×MIC)INH、RFP作用后10 d抗菌计数，CFU计数方法结果和PMAxx-qPCR方法测定结果对比分析见表5，两种方法测算一致性良好(P>0.05)(表5)，说明PMAxx-qPCR方法可有效快速检测抗菌药物活性。

讨 论

特异性膜渗透的核酸染料PMA与高敏感度的荧光定量qPCR检测技术结合，可以选择性检测细胞膜完整的活性病原菌，具有特异性强、定量准确、快速检测等优点，现已广泛应用于食品、检疫、农业、畜牧业等多领域微生物活性检测。本研究使用PMA改良类似物PMAxx[10]区分结核分枝杆菌H37Rv活菌和热灭活菌提供一个完整的方案，探讨方法应用的重要影响因素，并应用于抗结核药物的活性检测。

表5 不同MIC倍增浓度的INH、RFP作用10 d后的PMAxx-qPCR法抗菌计数和CFU计数结果的比较

注MIC：最低抑菌浓度；CFU：菌落形成单位

根据多项研究报道,该方法的建立存在多种影响因素[10]，包括PMA浓度[9]、细胞死亡方式[11]、样品的种类或浓度[12]等。在本研究中首先研究了曝光时间、暗孵育时间、试剂浓度等几项关键因素。研究结果表明，使用浓度为10 μmol/L PMAxx预处理H37Rv，经暗孵育10 min后曝光15 min，可有效区分活死菌，并避免各项干预条件导致的假阳性反应。Lu等[12]利用该方法检测痰中培养分离的结核分枝杆菌，发现延长暗孵育时间可有效提高PMA对死菌的检出率，适用浓度范围为100～800 μmol/L，Dorn-In 等[8]和Pholwat 等[9]研究得出适用浓度为50 μmol/L，均高于本研究中的10 μmol/L，导致以上差异的原因主要考虑以下两个方面：(1)本研究采用的是纯菌悬液，而Lu等[12]研究中目标是临床痰样本，Dorn-In等[8]研究目标为鹿肉和粪便样本中的结核分枝杆菌复合体，复杂性样本中非细胞物质可能影响PMA的渗透能力，因此需提高试剂浓度和延长预处理时间以提高其与死菌DNA的结合率；(2)本方法中应用的PMAxx已被证实渗透能力优于PMA[13], 所需量少且处理时间更短。另外，本研究发现PMAxx在检出效率上不受孵育时间影响。

qPCR是本方法检测的主要部分，因此标靶基因的识别和检测是影响方法实施的关键。本研究发现使用较长的靶标片段(206～433 bp)区分死活结核分枝杆菌较短片段(81～143 bp)有效，该发现与多项研究结果一致；Contreras等[14]研究发现，应用PMA-qPCR方法鉴别非活性鳗弧菌和嗜冷黄杆菌时，729 bp的靶标产物检出效率明显优于140 bp，且死活菌检测差异随靶标片段的扩大逐渐升高；Alonso 等[15]研究也发现应用PMA-qPCR方法检测热灭活的十二指肠贾第虫囊肿时，采用143 bp/133 bp靶标片段的检出率分别为97.0%和98.2%，而采用77 bp/75 bp时检出率明显降低(89.9%和83.2%)。以下原因可能解释该现象：据Opel等[16]报道，与DNA结合的PCR抑制剂主要通过影响DNA聚合酶的作用而影响延伸率，而长片段较短片段出现DNA聚合酶功能抑制的概率更高，因此使得长片段对该类抑制剂更为敏感。

本研究将优化后的PMAxx-qPCR方法直接应用于一线抗结核药物INH、RFP的体外抗菌活性检测，首先发现该方法在药物作用后3 d即可获得与国际通用的MABA法一致性良好的MIC结果，该发现与Pholwat等[9]研究结果一致。因此与需时较长的MABA法相比可有效提高检测效率。其次，本研究还通过Cq值/lg CFU/ml标准曲线转换获得药物作用后活菌计数，与传统CFU计数方法结果一致性良好。Scariot等[17]研究证实PMA-qPCR方法检测酸奶中副干酪乳杆菌和CFU计数法的结果具有极佳的符合率，Roussel等[18]也通过对大肠杆菌研究充分证实PMA-qPCR方法和CFU计数法结果的高度一致性。本研究证实PMAxx-qPCR方法对结核分枝杆菌菌落计数的测算同样有效，且最低检测限可至102CFU/ml，与Zi等[19]研究中的检测限结果一致。总之，PMA-qPCR方法在保证有效、准确、高敏感度评价药物抗菌活性的前提下，可大大节省时间成本，提高检测效率，具备成为药物抗菌活性研究及评价工具的潜力。

本研究的局限性在于应用PMAxx-qPCR方法仅评估INH、RFP两种抗结核药物，而抗结核药物种类繁多且作用靶点各异，仍需要完善对其他抗结核药物的活性检测以评估方法的应用价值。

本研究结果表明，PMAxx在适宜的处理条件下，可有效抑制对死菌DNA的扩增，联合qPCR时可作为一种快速、准确的分子药敏检测方法，敏感度高，可有效检测药物抗菌活性，与传统检测方法相比，一致性良好且需时更短。