张运辉 周小青 伍大华 杨梦琳 郑彩杏 童天昊 张祺杰

〔摘要〕 目的 探讨二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glycoside， TSG）和远志总皂苷（Tenuigenin， TEN）配伍对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的影响。方法 PC12细胞除空白组外运用Aβ25-35诱导建立阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）模型，被随机分成模型组、TSG（200 mmol/L）组、TEN组（100 mg/L）、TSG-TEN配伍组（TSG200 mmol/L+TEN100 mg/L）、多奈哌齐组（10 ？滋mol/L）。采用MTT比色法检测各组细胞存活率;取细胞上清液分别测各组的乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量及乙酰胆碱酯酶（AchE）、超氧化物歧化酶（SOD）活力;统计各组的细胞分化率。结果 （1）细胞存活率的高低为：TSG-TEN組>TSG组>多奈哌齐组>TEN组（P<0.01）;TSG组、TEN组、多奈哌齐组均低于TSG-TEN配伍组（P<0.01，P<0.05）;（2）与模型组比较，TSG组、TEN组、TSG-TEN配伍组可降低LDH含量、MDA含量、抑制AchE活力及增强SOD活力（P<0.05）。且TSG-TEN配伍组对降低LDH含量、MDA含量、抑制AchE活力及增强SOD活力效应比TSG或TEN单用组效应更好（P<0.01）;（3）PC12细胞的分化率高低为：TSG-TEN组>多奈哌齐组>TSG组>TEN组（P<0.01，P<0.05）;TSG组、TEN组、多奈哌齐组均低于TSG-TEN配伍组（P<0.01，P<0.05）。结论 TSG和TEN配伍对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤具有显著的协同保护作用，其作用机制可能与改善胆碱能系统、抗氧化应激、降低突触可塑性损伤有关，且TSG优于TEN。

〔关键词〕 阿尔茨海默病;远志总皂苷;二苯乙烯苷;突触可塑性

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of tetrahydroxy stilbene glycoside （TSG） and tenuigenin （TEN） on the injury of PC12 cells induced by Aβ25-35. Methods PC12 cells were induced by Aβ25-35 to establish a PC12 cell model of Alzheimer's disease （AD）. After modeling， PC12 cells were randomly divided into a blank group， a model group， a TSG （200 mmol/L） group， a TEN group （100 mg/L）， a TSG-TEN compatibility group （TSG 200 mmol/L + TEN 100 mg/L） and a donepezil group （10 umol/L）.  MTT colorimetry was used to detect cell viability in each group; The lactate dehydrogenase （LDH） and malondialdehyde （MDA） content， acetylcholinesterase （AchE） and superoxide dismutase （SOD） activity in cell supernatant of each group were measured. The cell differentiation rate of each group was caculated. Results （1） The cell survival rate was TSG-TEN group﹥TSG group﹥donepezil group﹥TEN group （P<0.01）. Compared with the TSG-TEN combination group， the TSG group， the TEN group and the donepezil group were lower than the TSG-TEN compatibility group （P<0.01， P<0.05）. （2） Compared with the model group， TSG group， TEN group and TSG-TEN combination group could decrease LDH and MDA content， inhibit the activity of AchE， and increase SOD activity （P<0.05）， and the effect of TSG+TEN compatibility group on reducing the content of LDH and MDA， inhibiting the activity of AchE， and increasing SOD activity was better than that of TSG or TEN alone group （P<0.01）. （3） The differentiation of PC12 cells was： TSG-TEN group﹥donepezil group﹥TSG group﹥TEN group （P<0.01）. Compared with the TSG-TEN combination group， the TSG group， the TEN group and the donepezil group were lower than the TSG-TEN compatibility group （P<0.01）. Conclusion The combination of TSG and TEN has a synergistic protective effect on PC12 cell injury induced by Aβ25-35. The mechanism may be related to the improvement of cholinergic system， anti-oxidative stress and reducing synaptic plasticity damage， and TSG is superior to TEN.

〔Keywords〕 Alzheimer's disease; tenuigenin; tetrahydroxy stilbene glycoside; synaptic plasticity

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种老年人中最常见的中枢神经系统的退行性疾病，其主要以进行性记忆丧失和认知缺陷为临床特征。近年来，许多学者研究证实，补肾化痰益智法对AD具有显著的防治作用[1-2]，故提出补肾化痰益智法为治疗AD的根本大法之一。补肾益智药何首乌配伍化痰药远志是临床上治疗AD的常用药对。研究已证明，何首乌的主要药效物质二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glycoside， TSG）能通過增高胆碱乙酰基转移酶乙酰/胆碱酯酶的比值、抗氧化应激、保护神经突触的结构和功能等明显提高拟AD动物模型学习记忆功能[3]。已有研究显示，远志的主要药效物质远志总皂苷（Tenuigenin， TEN）能显著调控胆碱能系统和抑制氧化应激损伤[4]。研究团队前期研究表明，TSG（200 mmol/L）和TEN（100 mg/L）分别是抑制AD损伤的主要有效剂量，且两者配伍对神经细胞损伤有显著的协同保护效应。因此，从胆碱能神经损害、氧化应激反应、突触可塑性损伤三方面继续探究TSG和TEN配伍对AD损伤的作用机制。

1 材料

1.1  细胞

大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞株PC12（永久性，高分化），购自湖南长沙赢润生物技术有限公司，编号为2015032007。

1.2  实验试剂

TSG（北京北纳创联生物技术研究院，批号130725，质量分数98%）;TEN（北京北纳创联生物技术研究院，批号111572-200702，质量分数为98%）;Aβ25-35（美国Sigma公司）;盐酸多奈哌齐片（中国卫材药业有限公司）;DMSO（Sigma公司）;FBS（吉泰远成生物科技有限公司，批号1133067）;AchE（批号20140912）、SOD 试剂盒（批号20140911）、MTT（批号20140916）、MDA试剂盒（批号20140904）、LDH试剂盒（批号20140911）均来自于南京建成生物工程研究所;DMEM细胞培养液[赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号NZL1253];10%新生小牛血清（Hyclone Lab）;PBS（北京索莱宝科技有限公司，批号20140605）等。

1.3  主要仪器

DL-CJ-2NDI型超净工作台（中国北京东联哈尔仪器制造有限公司）;Galaxy 170R型CO2培养箱（中国上海百赛生物技术有限公司）;UV1800ENG240V型紫外分光光度计（中国岛津有限公司）;Primo Vert型倒置显微镜（Carl Zeiss Jena德国）;Eppendorf 5804R型低温高速离心机（Eppendorf 5810R德国）。

2 方法

2.1  PC12细胞培养

用含5%马血清和10%胎牛血清的DMEM，在95% O2、5% CO2、37 ℃条件下培育PC12细胞，每隔1天传代1次，待PC12细胞增长至80%融合时，取0.25%胰酶消化细胞，随后调整细胞数至1×106个/mL，接种或传代于细胞培养板，取对数生长期细胞应用于实验。

2.2  TSG和TEN配伍剂量的确定

本课题组前期研究表明，TSG（200 mmol/L）和TEN（100 mg/L）是抑制AD损伤的有效剂量，且两者配伍对神经细胞损伤有明显协同保护作用。故拟定200 mmol/L和100 mg/L分别为TSG和TEN抗AD细胞损伤的配伍剂量。

2.3  分组及药物干预

待细胞至对数生长期时，将上述方法“2.1”培养的PC12细胞，以2×105/mL密度，随机接种于96孔培养板中，每孔滴加100 μL细胞悬液，分为6个组，每组为8个孔。用20 μmol/L Aβ25-35诱导PC12细胞建AD模型[5]。24 h后6组分别进行不同的药物干预：（1）空白组（正常的PC12细胞），（2）模型组（20 μmol/L Aβ25-35），（3）TSG组（20 μmol/L Aβ25-35+200 mmol/L TSG），（4）TEN组（20 μmol/L Aβ25-35+100 mg/L TEN），（5）TSG-TEN组（20 μmol/L Aβ25-35+200 mmol/L TSG+100 mg/LTEN）组，（6）多奈哌齐组（20  μmol/L Aβ25-35+10 μmol/L多奈哌齐）。均继续培育24 h。

2.4  MTT比色法检测各组的细胞存活率

将5×MTT稀释成1×MTT溶液;每孔滴加50 μL 1×MTT溶液，37 ℃培养箱孵育4 h;弃上清液，每个孔滴入200 μL DMSO，并在平板摇床上摇2～3 min使其充分混匀。使用酶标仪在570 nm波长处测各个孔的OD，计算PC12细胞的存活率。

2.5  细胞分化率测定

将96孔培养板置于倒置显微镜（10×40）下观察，每个孔随机选择5个视野，每个视野记录细胞总数与具有突起的细胞数量，算出各组细胞分化率并进行比较，观察药物对细胞突起的保护作用。细胞分化率的计算公式如下。

2.6  PC12细胞中LDH、MDA含量及AchE、SOD活力检测

加药培育24 h后，利用细胞刮彻底收集细胞，超声破碎细胞后4 ℃下3 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液并按照试剂盒方法测定细胞均浆中的LDH、MDA含量及AchE、SOD活力。

2.7  统计学处理

实验数据用“x±s”表示，用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间差异比较用单因素方差分析，方差齐者用LSD检验分析（方差不齐者先将数据转换后使之方差齐），P<0.05说明差异有统计学意义。

3 结果

3.1  各组PC12细胞的细胞存活率和分化率比较

与空白组比较，模型组的PC12细胞的存活率明显减低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，TSG组、TEN组及TSG-TEN组PC12细胞的存活率均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），并且细胞存活率的大小为：TSG-TEN组>TSG组>多奈哌齐组>TEN组（P<0.01）;与TSG-TEN组相比，TSG组、TEN组、多奈哌齐组均明显低于TSG-TEN组（P<0.01，P<0.05）。见表1。

与空白组相比，模型组的细胞分化率明显降低，差异显著（P<0.01）;与模型组比较，各组PC12细胞的细胞分化率明显增高，差异明显（均P<0.05），TSG-TEN组及多奈哌齐组均增高明显（P<0.01，P<0.05），且比TSG组和TEN单用组增高更显著（P<0.01）。PC12细胞的细胞分化率高低为：TSG-TEN组>多奈哌齐组>TSG组>TEN组（P<0.01）。与TSG-TEN组相比，TSG组、TEN组、多奈哌齐组均明显低于TSG-TEN配伍组（P<0.01）。见表1。

3.2  检测各组PC12细胞中LDH、MDA含量及AchE、SOD活力

与空白组比较，模型组LDH、MDA含量、AchE活力明显升高，SOD活力明显减低，（P<0.01，P<0.05）;与模型组相比，用药组LDH、MDA含量，AchE活力显著减低，SOD活力明显增高（均P<0.05），且TSG-TEN组及多奈哌齐组对降低LDH和MDA含量、抑制AchE活力及增强SOD活力的效应比TSG或TEN单用组更好（P<0.01）。见表2。与TSG-TEN组比较，多奈哌齐组、TSG组、TEN组的LDH含量、MDA含量、AchE活力均高于TSG-TEN组，且SOD活力均明显低于TSG-TEN组（P<0.01，P<0.05）。见表2。

4 讨论

AD是一种主要以进行性认知功能障碍、精神行为障碍、日常生活能力障碍为主要表现的神经变性性疾病。大量的研究显示，胆碱能系统损伤和氧化应激反应是导致AD产生的两大重要机制。多项研究表明，乙酰胆碱（ACh）的缺失和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性增高是AD胆碱能损伤的主要表现[6-7]。大量研究证实，丙二醛（MDA）含量增加、LDH漏出量增多、超氧化物歧化酶（SOD）活性减低是AD氧化应激反应的重要表现[8-9]。突触可塑性能维持神经细胞和神经环路的稳定性，与细胞改变紧密相关，在学习记忆中发挥极为重要的作用，同时也是神经系统疾病信号转导的分子机制[10-11]。海马神经细胞的突触丢失和突触可塑性改变在AD的早期病理过程中发挥极为重要的作用，在AD学习和认知功能障碍的发病机制中具有重要的地位[12]。因此，胆碱能神经损伤、氧化应激反应及突触的可塑性损伤是导致AD发生发展的重要机制。

本研究主要是在补肾化痰益智法指导下，根据中药方剂配伍理论，选择临床上常配伍使用的补肾药何首乌和化痰药远志进行配伍，对补肾药何首乌的有效成分TSG和化痰药远志的有效成分TEN进行配伍研究，用中药有效组分配伍模式研究何首乌和远志有效组分配伍治疗AD的组方规律，寻找其治疗AD的有效配伍组合，并从Aβ25-35所致AD模型PC12细胞的神经损伤及胆碱能系统、氧化应激反应、突触可塑性损伤等方面探讨TSG和TEN配伍组方抗AD的作用机制，从而形成一个组方简单、成分清楚、作用明确、机制明了、质量可控、安全有效的新型中药有效组分配伍组方。

多奈哌齐是第2代胆碱酯酶抑制剂，是全世界唯一一种同时被美国FDA和英国MCA批准上市对症治疗轻、中度AD的新药。它分别在美国、日本和英国进行了Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期临床研究验证，目前已经在40多个国家和地区上市销售。该药对神经中枢AchE有显著的选择性，其治疗作用是通过可逆性、选择性地抑制AchE对Ach的水解而增加受体部位的乙酰胆碱含量，从而提高阿尔茨海默病患者的认知和记忆能力，却很少出现外周的不良反应。多奈哌齐疗效与他克林相似，却有显著的临床安全性和很好的耐受性。所以本课究选用多奈哌齐作为阳性对照药。

AchE是胆碱能系统神经细胞的标志酶之一，可催化Ach降解，其活性越高，Ach含量越低，两者呈负相关。因此，降低AChE的活性能减少Ach降解，提高Ach含量，从而提高学习记忆能力。本实验结果显示TSG和TEN配伍组能显著降低Aβ25-35诱导的PC12细胞的AChE的活性，并且比单用组效果更明显，提示二者配伍能协同改善Aβ25-35诱导的PC12细胞的胆碱能系統损伤。自由基的产生会诱发脂质过氧化反应，所产生的脂质过氧化终产物MDA会导致AD的神经元凋亡。所以，MDA含量的高低能间接反映AD自由基的变化。SOD是机体内天然的氧自由基清除剂，是清除自由基酶系统中非常重要的酶类，故SOD活力的高低水平能间接反映机体清除氧自由基的能力。LDH是一种细胞内的糖酵解酶，广泛分布于细胞浆内，LDH是细胞损伤的重要标志，当细胞受损或细胞膜通透性发生改变时，LDH会释放至胞外，引起培养上清液中LDH活性增强，因此，细胞培养液中LDH 的活性可以客观衡量细胞受损程度。本实验结果显示TSG和TEN配伍组能显著降低Aβ25-35诱导的PC12细胞的MDA含量和LDH，明显提高SOD活性，并且比单用组效果更明显，提示二者配伍能协同抗Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激损伤。神经细胞的突触可塑性与学习记忆关系密切，其间接反映了整个神经系统回路的可塑性，是AD患者学习记忆渐进性损害并最终导致痴呆的直接原因。而细胞分化并长有突起是突触可塑性的主要表现。本实验结果显示TSG和TEN配伍组能显著提高Aβ25-35诱导的PC12细胞的细胞分化率，并且比单用组效果更明显，提示二者配伍能协同改善Aβ25-35诱导的PC12细胞的突触可塑性。本实验结果显示TSG和TEN配伍组能显著改善Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤并具有明显的协同作用，其作用机制可能与改善胆碱能系统损伤、抗氧化应激、改善突触可塑性损伤有关，且TSG的作用优于TEN。

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