徐曼，次晓蕊，吕媛媛，张娟娟，3，管敏鑫

（1.温州医科大学检验医学院生命科学学院Attardi线粒体生物医学研究院，浙江温州325035；2.宁波医疗中心李惠利医院检验科，浙江宁波315040；3.温州医科大学附属眼视光医院科研中心，浙江温州325027）

Leber遗传性视神经病变（Leber’shereditaryopticneuropathy，LHON）是一种由于视网膜神经节细胞及其轴索受到病理性损伤而导致的母系遗传性眼病[1]。临床主要表现为双眼同时或先后、急性或亚急性无痛性视力损伤，同时可伴有中心视野缺失及色觉障碍，青壮年男性好发[2-3]。线粒体DNA（mtDNA）突变是LHON的分子基础，MT-ND411778G＞A，MT-ND614484T＞C和MT-ND13460G＞A为LHON的3个原发突变，在白种人中，90%以上LHON患者携带3种原发突变之一[4]，而3个原发突变约占中国LHON家系的50%[5-7]。线粒体tRNA突变（tRNAMet4435A＞G，tRNAGlu14693A＞G和tRNAThr15951A＞G突变）协同3个原发突变增加LHON的外显率和表现度[8-10]。线粒体tRNA突变使tRNA的结构和功能受到影响，使得tRNA代谢功能缺陷，线粒体的翻译和呼吸功能异常，导致线粒体ATP产量降低，ROS产生增加，影响对线粒体依赖性较高的视网膜神经节细胞，导致LHON的发生[1，11]。线粒体tRNAPhe593T＞C突变可能增强携带m.11778G＞A突变的中国LHON家系的外显率[12]。为进一步研究线粒体tRNAPhe593T＞C突变是否影响携带其他2个原发突变的中国LHON家系的外显率和表现度，本研究对收集的742例中国汉族LHON患者进行了线粒体全基因组测序，发现18个携带tRNAPhe593T＞C突变的LHON家系，并对其中4个家系进行进一步分析。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2004年4月至2019年9月，课题组收集的全国各地多家医院的LHON患者742例，经温州医科大学伦理委员会的许可，在所有受检者签署知情同意书的情况下，采集血样并且收集相关临床资料。同时，采集376名中国正常人血样作为对照。对收集的742例汉族LHON患者进行线粒体全基因组测序，发现18个携带tRNAPhe593T＞C突变的LHON家系（对照组中只有1个携带此突变的家系），并对其中4个家系进行进一步分析。

1.2 方法

1.2.1 眼科临床检查：对家系先证者和其他成员进行眼科临床检查，包括视力、视野、色觉、眼位、眼压、眼底、瞳孔对光反射、视觉诱发电位（visualevokedpotential，VEP）、眼底成像等。WHO定义的视力损伤程度的标准：轻度：0.3～0.1；中度：0.1～0.05；重度：0.05～0.02；极重度：小于0.02。

1.2.2 线粒体基因组突变分析：采集4 个家系先证者及其他母系成员外周静脉血经EDTA-K3抗凝后，用经典的苯酚/氯仿法手工提取基因组总DNA（内含线粒体DNA），再对提取的基因组DNA用紫外分光光度计进行浓度和纯度检测（NanoDrop2000，美国ThermoFisher公司），以提取的DNA作为PCR扩增的模板进行扩增反应。在1%的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，将产物送至杭州擎科生物科技有限公司对线粒体基因组进行全序列测序。最后，测序结果由DNASTAR等软件并与修正的剑桥参考序列（therevisedCambridgeReferenceSequence，rCRS，NC_012920.1）[13]进行比对分析。

1.2.3 线粒体单体型分析：4 个家系先证者的测序结果经DNASTAR软件分析后，找出全序中所有突变位点。再根据mtDNAtreeBuild17（18Feb2016）（http：//www.phylotree.org）中的rCRS进行比对，确定各自的线粒体单体型。

1.2.4 tRNA结构分析：根据tRNAPhe的序列和存在m.593T＞C突变的tRNAPhe序列，在Mathewslab：ComputationalBiologyofRNA.（http：//rna.urmc.rochester.edu/）中，经以下四个算法进行二级结构预测：①Partition，对单个序列进行配分函数计算，计算碱基对概率；②Fold，预测序列的一组低自由能结构中的最低自由能结构；③MaxExpect，生成一个或多个由高度可能碱基对组成的结构；④ProbKnot，预测可能碱基对的二级结构。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS16.0软件进行数据分析。统计病例组和对照组中携带m.593T＞C突变的例数，以χ2检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本筛查 通过对收集的742个中国汉族LHON患者和376 个正常人对照进行筛查，发现18 个携带m.593T＞C家系和1个对照携带m.593T＞C家系，两种突变的发生率差异有统计学意义（P ＜0.05）。本研究选取4个家系（编号为：WZ133、WZ1224、WZ1225和WZ1260，见图1）进行进一步分析。

2.2 临床分析 WZ133来自湖北，先证者（III-6）现32岁，2004年12月发病，无诱发因素，无既往病史，无吸烟饮酒史，双眼同时视力无痛性渐进性下降，视力检查右眼：0.02，左眼：0.05，经治疗视力无明显改善。次年4月到北京某医院眼科就诊，视力：右眼：0.05，左眼：0.04；眼底：双视乳头界清，颞侧色淡，右黄斑区反光强，中心凹反光隐见，左黄斑中心光反射消失；双眼瞳孔对光反射迟钝等，表现为典型的LHON临床特征。家系中的II-2和II-7发病，补充眼科检查，但其他母系成员视力正常，也无其他疾病，外显率为42.9%。WZ1224来自河北，先证者（II-9）现47岁，23岁时无明显诱因视力下降，眼底检查示视盘苍白等。家系中其他7位母系成员无视力障碍，也无其他疾病，外显率为12.5%。WZ1225来自河北，先证者（III-6）现18岁，10岁发现左眼视物不见，于同年12月于河北省某医院就诊，眼底检查示视盘苍白等，具有典型的LHON临床表现。家系中其他7位母系成员视力均无异常，也无其他疾患，外显率为12.5%。WZ1260来自浙江，先证者（III-1）现16岁，9岁时因双眼先后视力骤降就诊，诊断为LHON。家系中其他17位母系成员均无视力障碍及其他疾病，外显率为5.6%。见表1-2。

图1 4个LHON家系图

表1 4个家系先证者及其他患者临床资料总结

表2 4个家系临床资料总结

2.3 线粒体基因组分析 测序结果经DNASTAR等软件并与修正的rCRS进行比对分析后，发现4个先证者的mtDNA序列上携带多个变异位点（见表3），包括：D-loop区有26个；MT-RNR1有4个；MT-RNR2有2个；蛋白质编码区有41个同义突变，18个错义突变。其中，4个先证者同时携带m.593T＞C同质性突变（WZ133-III-6同时携带了m.14484T＞C同质性突变，见图2）和其他11个相同的突变。通过对人、大猩猩、小鼠、狗、牛、马、蓝鲸和非洲爪蟾这8种具有代表性的脊椎动物的mtDNA种系发生学进行分析，我们发现有28个变异位点在进化上保守。除了MTTF593T＞C和MT-ND614484T＞C外，未发现LHON相关的其他突变（http：//www.mitomap.org）。

2.4 线粒体单体型分析 与核基因组相比，线粒体基因组更容易积累突变，这主要是由于线粒体基因缺乏组蛋白的保护，其自身不但不存在有效的修复机制，还处于高复制率状态，这样增加了出错的可能性，更重要的是mtDNA分子与呼吸链复合物紧密接触，它们暴露在高超氧化物的环境中，更容易受损[2]。由于线粒体DNA属于母系遗传，线粒体DNA突变沿着放射的母系遗传积累。当线粒体DNA在特定环境中获得有益的功能突变时，这种线粒体DNA得到选择性的富集，并在这样的环境中形成了一组线粒体DNA单体型相关群体，被称为线粒体单体型[14]。在美洲土著居民首次发现的mtDNA单体型被命名为A、B、C和D[15]。本研究的4个家系的先证者分别属于C7a、M7c1b2b、H2a2和D4b2b2单体型，其单体型树见图3。

表3 4个先证者线粒体DNA全序列突变位点分析

续表3-1

续表3-2

图2 4个LHON家系先证者及正常对照者tRNAPhe的部分测序峰图

图3 4个LHON家系先证者mtDNA序列的单倍型树（包含修改后的rCRS）

2.5 线粒体tRNA二级结构分析 自由能的大小是衡量RNA结构在体内是否稳定存在的一个指标。近几十年来，自由能最小化是RNA二级结构与预测中最常用的方法，利用热力学原理，仅需原始序列（在没有三级结构或蛋白质相互作用信息的情况下）即可准确预测RNA二级结构[12，16]。自由能越低，结构就越稳定[17]。在m.593T＞C存在的情况下，线粒体tRNAPhe的二级结构发生改变（见图4）。野生型线粒体tRNAPhe二级结构预测的自由能（ΔG）为-9.5，而存在m.593T＞C突变的tRNA的二级结构预测的自由能（ΔG）为-6.5。m.593T＞C突变使得线粒体tRNAPhe的二级结构发生改变，自由能增加，影响了tRNAPhe结构的稳定性。

图4 野生型线粒体tRNAPhe和tRNAPhe593T＞C二级结构预测图

3 讨论

本研究对4个中国汉族LHON家系的临床、遗传和分子生物学特征进行研究。从临床角度来看，虽然这4 个家系先证者和部分母系成员具有典型的LHON临床特征即双眼同时或先后出现急性或亚急性无痛性视力损伤，而且还与LHON的男性好发这个临床特征很吻合，但是他们的发病年龄、病情严重程度以及外显率均有差异。4个家系的发病年龄为9～23岁，平均16岁，与张永梅等[9]报道的携带tRNAGlu14693A＞G的3个中国LHON家系（平均发病年龄为9岁）和LIANG等[18]报道的携带ND13394T＞C的4个中国LHON家系（10岁）的平均年龄相比要大一些。但是，比孙艳红等[19]报道的仅携带14484原发突变位点（19.48岁）的3个中国LHON家系和QU等[20-21]报道的仅携带m.11778G＞A突变（30.5岁）的9个中国汉族LHON家系的平均发病年龄要小。4个家系患者的视力损伤程度从轻度到重度不等，WZ133-III-6和WZ133-II-2均属重度。4个家系的外显率也有差异，分别为42.9%、12.5%、12.5%和5.6%，其中WZ133家系的外显率明显高于其他家系。

在线粒体基因组分析中发现，4 个先证者同时携带MT-TF593T＞C同质性突变，其中WZ133家系的先证者也携带了m.14484T＞C突变。m.14484T＞C突变是3个原发性突变之一，同m.3460G＞A突变一样，也是比较罕见的[2]。孟祥娟等[22]报道的中国人群携带m.14484T＞C突变的LHON线粒体单体型及多态位点分析中，携带m.14484T＞C突变的51例家系LHON平均外显率为21.5%，经线粒体基因组和单体型分析后发现线粒体单体型M10a可能增加视力损伤的风险。仲俊维等[1]报道的LHON外显率的影响因素研究进展中指出：m.14484T＞C突变主要与单倍群J1相关。而本研究中，同时携带线粒体tRNAPhe593T＞C突变和m.14484T＞C突变家系的LHON外显率近乎是此报道中平均外显率的2倍，并且此先证者单体型分别为C7a，并不属于LHON高发单体型；这就意味着，单体型可能不是影响外显率的主要因素。那么此家系有可能是由于合并了线粒体其他突变而对外显率和表型产生了影响。

在本研究中，4个先证者共同携带一个致病性突变（tRNAPhe593T＞C），且与非综合征型耳聋相关[23]，但这4个先证者除了有LHON的症状以外，均无其他疾病。有报道，线粒体tRNAPhe593T＞C突变可能增强携带m.11778G＞A突变的中国LHON家系的外显率[12]。那么同时携带tRNAPhe593T＞C突变和m.14484T＞C原发性突变的WZ133家系具有如此高的外显率，可能是由于tRNAPhe593T＞C突变的协同作用。在本研究中，线粒体tRNAPhe593T＞C突变虽然在进化上不保守，但是经RNAPhe二级结构预测发现：与野生型线粒体tRNAPhe相比，存在m.593T＞C突变的tRNA二级结构发生改变，且自由能增加，影响了tRNAPhe结构的稳定性。tRNAPhe结构受到影响，就会导致其功能紊乱，影响翻译甚至影响基因的表达。那么同时携带tRNAPhe593T＞C突变和m.14484T＞C原发性突变的WZ133家系具有如此高的LHON外显率，可能是由于二者的协同作用。

综上所述，m.593T＞C突变的存在增加了m.14484T＞C家系LHON的外显率。尽管m.593T＞C位点在人类线粒体DNA中不具有进化保守性，突变率也不高，但经tRNA二级结构预测发现，该突变的存在改变了tRNAPhe的二级结构，也影响了结构的稳定性。这些证据表明，在LHON的外显率上，m.593T＞C和m.14484T＞C突变可能会有协同作用。需要更多的研究来验证我们目前的发现，并揭示线粒体tRNAPhe基因变异对m.14484T＞C致病性的影响。