王明煬 岳 琨 湛佳兴 周 琦 刘庆阳 徐凯智

华北理工大学研究生学院；

①附属医院肿瘤放化疗科 河北唐山 063000；②应急总医院转化医学实验室与肾内科；③唐山工人医院麻醉科

黄芪是我国传统中草药之一，常用作混合草药煎剂中的免疫调节剂，用于治疗感冒、腹泻、疲劳、厌食和心脏病[1-2]。黄芪的药理活性成分包括多种多糖、皂苷和黄酮类化合物[3]，目前对黄芪多糖(APS)药理作用的研究最为广泛，主要研究其免疫增强特性，如刺激小鼠免疫细胞增殖和体外细胞因子的产生[4]。除此之外，临床研究还表明，APS可以减轻化疗药物的副作用，如可显著降低癌症患者骨髓抑制程度[5]。但是，APS在中枢免疫和非免疫器官中的调节机制尚不清楚。据报道，脓毒症被称为手术中的顶级杀手之一，在过度炎症反应后会引起免疫麻痹，从而导致免疫细胞严重耗尽[6-9]。由于脓毒症新定义的发展，说明非免疫器官在败血症发病机制中的作用非常重要[9]。本研究旨在探讨APS如何影响中枢免疫器官细胞和外周非免疫器官细胞以逆转脓毒症小鼠的免疫麻痹。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选择6～8周龄、体质量约20g的雄性BALB/c小鼠，购自中国医学科学院实验动物中心。动物证号：SCKK(京)2014-004。在20℃～22℃、湿度(55±5)%的环境下分开饲养一周，维持正常的昼夜规律，不限制摄入水和食物。

1.1.2 实验仪器与试剂 培养皿、剪刀、离心机、细胞过滤器、流式细胞仪、超净台、CO2培养箱、黄芪多糖(批号021001B)、铜绿假单胞菌、胶原酶D 溶液、生物素化的小鼠树突细胞富集混合物、RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100IU/ml)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验模型制作 制备全层皮肤烧伤小鼠模型。小鼠腹部表面10%的烫伤，并在烧伤后1 天进行铜绿假单胞菌腹膜内注射(1×107CFU/ml)，将小鼠随机分为4组：对照组和APS 低、中、高 剂 量 治 疗 组(APS 40、100、250 mg/kg腹腔注射)，各10 只。自由进食饮水，保持正常的昼夜节律变化，观察各组小鼠在致死菌攻击下的死亡率，分别在0、3、5、7天4个时间点获取骨髓和肝脏细胞，并观察其数量变化。

1.2.2 获取免疫细胞 使用25号针头从小鼠的胫骨和股骨中吸出骨髓细胞。将肝脏和骨髓细胞的沉淀物重悬于PBS 1%牛血清白蛋白中，然后调节至1×106/ml，并通过荧光激活细胞分选仪在明亮的绿色细胞上进行分析。在2～3 mL RPMI 1640培养基中获得外周血并用红细胞溶素处理，离心后收集沉淀细胞。将分离的肝脏置于具有足够胶原酶D 溶液的6c m培养皿中以完全覆盖培养皿的底部。然后使用1 mL注射器和25G 针头向肝脏注射胶原酶D溶液，将组织切成小块。将肝脏置于胶原酶D溶液中37℃温育30分钟，将其轻轻地通过细胞过滤器。通过Ficoll Paque分离肝脏免疫细胞。

1.2.3 纯化CD11c-CD45RBhigh DCs[10]采用小鼠树突状细胞富集-DM 技术，在骨髓细胞和肝脏免疫细胞中阴性选择DC。在纯化的DCs中，使用生物素化抗小鼠CD11c单克隆抗体和I Mag 链霉亲和素颗粒对 CD11c-CD45RBhigh DCs进行负选择。流式细胞仪检测CD11c-细胞纯度达95%以上。采用流式细胞仪(FACS Aria II)分离骨髓和肝脏CD11c-CD45RBhigh DCs。采用荧光活化细胞分选法(FACS)测定CD11c-CD45RBhigh DCs的纯度为＞98%。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件分析和处理数据。计量资料组间比较采用成组t检验，组内比较采用重复测量设计的方差分析，数据用(¯x±s)表示；计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠死亡率比较 APS中、高剂量组与对照组相比死亡率差异有统计学意义(P＜0.05)。APS高剂量组与中、低剂量组相比死亡率差异具有统计学意义(P＜0.05)。由此可见APS能够降低脓毒症小鼠的死亡率，并且其保护作用与APS剂量呈正相关，见图1。

图1

2.2 骨髓细胞和肝脏细胞变化的比较

2.2.1 骨髓细胞比较 第3、5、7天：APS高、中剂量组与对照组相比细胞变化具有统计学意义(P＜0.05)；APS高剂量组与低剂量组相比细胞变化具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.2.2 肝细胞比较 在第3、5、7天：APS高、中剂量组与对照组相比细胞变化具有统计学意义(P＜0.05)；APS高剂量组与低剂量组相比细胞变化具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

骨髓和肝脏细胞中CD11c-CD45RBhigh DCs百分比在第3天与第7天变化具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

表1 骨髓中免疫细胞数量比较(¯x±s，n=10)

图2

3 讨论

目前的研究已经证实，APS对烧伤和感染引起的败血症小鼠有保护作用，可降低其死亡率。因此，我们试图通过骨髓细胞增殖分化为CD11c-CD45RBhigh DCs突出免疫器官和非免疫器官之间的免疫协调，揭示APS通过其对免疫的影响治疗烧伤后脓毒症的机制。本研究注意到APS可以降低烧伤脓毒症的死亡率(图1)，并增加骨髓和肝细胞的数量(表1、2)。骨髓细胞负责外周免疫，树突细胞(DCs)是专业的抗原呈递细胞(APCs)，专门用于捕获、加工和转运抗原至淋巴器官，在淋巴器官中激活抗原特异性幼稚T 细胞[11]，DCs在控制适应性免疫中也起重要作用[12]。最近有报道调节性DCs (CD11cdi mCD45RBhigh DCs/CD11c-CD45RBhigh DCs)通过负免疫调节诱导外周耐受[13]和免疫平衡的影响[14]。因此，在脓毒症信号和APS刺激诱导的骨髓增殖和分化基础上，阐明体内CD11c-CD45RBhigh DCs在免疫器官和非免疫器官中变化的关键机制具有重要意义。

2016年Singer M 等[9]在JAMA 上提出了脓毒症的新概念：即宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，其高病死率和不易发现的多器官功能障碍综合征(MODS)发病机制引导研究者关注于免疫器官，但是非免疫器官也不可忽视。根据我们的数据，非免疫器官在免疫逆转阶段的功能似乎比垂死状态更好。同时，免疫逆转过程中的脓毒症小鼠可能通过CD11c-CD45RBhigh DC降低过度炎症反应，从而减少脓毒症小鼠的死亡率。CD11c-CD45RBhigh DC 是DC 的 子 集，研 究 表 明，CD11c-CD45RBhigh DCs可以从存在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-10的骨髓细胞中提取，活化后分泌高水平的IL-10，在体内和体外诱导Treg1细胞的产生。与正常DC产 生 促 炎 性 细 胞 因 子 不 同，CD11c-CD45RBhigh DCs产生较少的促炎性细胞因子，而 是 优 先 产 生IL-10[15]；而 CD11c-CD45RBhigh DCs中IL-12 的表达受到抑制。炎性细胞因子的增加可能加强病理改变并促进肝功能衰竭的进展[16]。脓毒症小鼠CD11c-CD45RBhigh DCs的存在能明显抑制炎症因子的水平。此外，来自具有内毒素耐受性的小鼠的CD11clowCD45RBhigh DC 比正常小鼠的CD11clowCD45RBhigh DC更有效地抑制肝脏炎症[17]。

Mandragos E 等[18]在研究中得出结论：多发伤能提高患者的免疫力，对感染具有防护作用，并且认为IL-10在其中起主导作用。另有研究发现内毒素抵抗的C3 H/HeJ小鼠菌株也能抵抗出血性休克引起的死亡。在本研究中我们发现单纯的烧伤脓毒症小鼠在后期免疫细胞也增加。所以我们认为感染甚至是烧伤等物理损伤都能不同程度得引起机体免疫状态的增强，以抵御机体受到二次攻击。

综上所述，我们认为APS通过刺激骨髓细胞的增殖分化，增加骨髓以及肝脏中的CD11c-CD45RBhigh DCs来降低烧伤脓毒症小鼠的死亡率。