高长曌，李方琪，严 婧，高一祯，夏晶莹，郭冉冉，张 玉，杨丹聃

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.吉林大学临床医学院；3.吉林大学基础医学院)

免疫调节在人体及动物中发挥着重要的作用，一旦调控失衡，可能会造成如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等多种自身免疫病。同时，利用正确调控的免疫调节机制，可以调节免疫缺陷疾病、感染性疾病、慢性病及肿瘤和癌症等的治疗。现有临床较多采用西药治疗的方法，但其具有作用单一、毒副作用明显、没有特异性疗效等缺点。中药因其含有多种免疫活性成分、多靶点、毒副作用小等优点，越来越得到临床等广泛认可。最近，也有不少研究机构在食物免疫调节疾病治疗方面也取得突破性研究进展，哈佛医学院的科学家发现像西兰花这种我们常见的食物中含有的天然分子3-吲哚甲醇(I3C)可以通过调节抑制肿瘤生长[1]。国内也有许多食物有效成分的研究。香菇多糖能够减轻化疗所诱发脂代谢紊乱[2]。枸杞多糖(LBP)存在于枸杞子钟，为其活性成分，有增强机体的免疫功能和显著的抗肿瘤效应,其能带动机体主动免疫能力，杀伤肿瘤细胞等等[3]。本实验选取淮山药、薏米、蒲公英、酸枣仁4种日常生活常见的食物，同时是药食同源的大宗药材，其主要成分在各种文献报道中发现有不同程度提高机体免疫水平的作用[4-7]。构建环磷酰胺免疫抑制模型探讨4种中药对免疫抑制小鼠机体的特异性及非特异性免疫功能的具体调控作用，为其日后在临床免疫疾病、肿瘤等的治疗中应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SPF级6-8周ICR小鼠，体重18-22 g，90只均为雄性，购自长春市亿斯实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)2018-0007。

1.2 实验药品与试剂

蒲公英、淮山药、酸枣仁、薏米4种药材，每种300 g均购自长春市吉深药店，且已粉碎加工，过12目筛。注射用环磷酰胺(CTX)，批号：18022625，规格每只0.2 g,江苏盛迪医药有限公司生产。1640培养基，GIBCO生产。新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司生产。鼠IgG ELISA 试剂盒、鼠IL-12 ELISA 试剂盒和鼠INF-γ试剂盒，上海酶联生物科技有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1试剂配制 采用传统水煎法供试药液配制。按要求称取药材，用药材6.5倍量水浸泡，武火煮至沸腾后用文火继续煮至1.0 h，倒出药液并过滤，向药渣中加2倍蒸馏水进行二煎，武火煮至沸腾后用文火继续煮至1.0 h，倒出药液并过滤，向二煎药渣中再加2倍蒸馏水进行三煎，武火煮至沸腾后用文火继续煮至1.0 h，倒出药液并过滤，合并三次所得的滤液,99-100℃浓缩至1.0 g/ml,即得所需药液，50 ml离心管，标记，4℃冰箱贮存。

1.3.2实验设计 小鼠根据体重随机分成6组(每组15只)，称量记录每组小鼠的初始体重。分别设计为空白组、模型组、蒲公英组(5.0 g/kg)、酸枣仁组(5.0 g/kg)、淮山药组(5.0 g/kg)、薏米组(5.0 g/kg)。除空白组和模型组灌喂0.9%生理盐水外，其余各组每天灌喂一次相应受试药物，连续14天。给药第4天起，除空白组，其余隔3天注射一次环磷酰胺建立免疫抑制模型。

1.3.3增重率与免疫器官脏器指数 实验结束后，对小鼠称重，计算增重率=(最终体重-初始体重)/初始体重×100%。末次给药后，小鼠摘眼球处死。取脾脏和胸腺称重，并观察，计算相应脏器指数(mg/g)=脏器重量(mg)/体重(g)。

1.3.4血清溶血素的测定 给药第11天，小鼠腹腔注射0.2 ml 5%鸡红细胞悬液(CRBC)，末次给药24 h后，摘眼球取血到EP管中，待血清析出，取上层血清到新的离心管，3 500 r/min分离血清，4℃备用。血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清0.1 ml于试管中，与10%CRBC悬液0.05 ml混合置冰浴，再加10%补体0.1 ml混合，同时设置不加血清的对照组。37℃恒温水浴30 min后，立即冰浴终止反应。2 000 r/min 离心10 min，取上清0.1 ml，加都氏试剂0.3 ml，混匀，放置10 min后，取上清转移至96孔板，同时设置半数溶血组，用酶标仪于λ=540 nm，测定吸光度值(OD)，以对照组做空白调零，同时设空白对照，血清对照，补体对照，鸡血对照，实验均设副孔。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，

HC50=(样品光密度值/CRBC半数溶血时光密度值)×稀释倍数。

1.3.5免疫球蛋白、血清IL-12、 IFN-γ含量测定 末次给药12 h后，眼眶取血，离心，收集血清，按照ELISA试剂盒提供的方法检测血清中IgG、IL-12、IFN-γ含量。室温平衡20 min后，向酶标板中分别加入不同浓度的标准品和稀释后的待测血清样品50 μl，同时设置空白孔，实验均设副孔。盖封板膜，37℃培养箱中孵育30 min。弃液，甩干，洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加入酶标抗体100 μl，37℃孵育60 min，弃液，甩干，洗涤液反复洗5次，拍干。依次每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μl，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。根据标准品浓度和OD值，运用Origin软件获得标准曲线的回归方程，计算出待测样品IgG、IL-2、IFN-γ含量水平。

1.3.6脾淋巴细胞增殖反应 取小鼠脾脏研磨，用含5%小牛血清(FCS)的培养液制备悬液，计数，调细胞浓度至1×107/ml，每孔体积100 μl接种到96孔板，每实验组均设3副孔，对照组每孔补加100 μl的5%FCS培养液，刺激组每孔加100 μl的10 μg/ml的ConA。37℃ 5%CO2培养箱中，培养48 h。每孔加MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，继续孵育2 h，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加100 μl 二甲亚砜(DMSO)，震荡，使结晶物充分融解。在570 nm波长，酶标仪上测定各孔光吸收值(空白孔调零)。结果判定：SI (刺激指数) =Con A刺激孔A值/对照孔A值。

1.3.7吞噬 饲养结束前两天，小鼠腹腔注射5%淀粉溶液1 ml，最后一次给药后，腹腔注射3%鸡红细胞悬液0.5 ml，60 min后处死小鼠，腹腔打入2 ml生理盐水，吸出腹腔液腹腔液在载玻片上涂片，Giemsa-wright染色液染色，40倍镜显微镜下查找100个巨噬细胞观察计数。结果判定：吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬细胞数/ 100×100%；吞噬指数:有吞噬作用的巨噬细胞吞入的鸡红细胞总数/100。

1.4 统计学分析

数据结果用平均值±标准差方式表示，采用SPSS 25.0软件进行多组均数间的单因素方差(ANOVA)分析，两组均数间的相互比较采用LSD或 Dunnett法进行差异显著性检验，结果P<0.05为差异显著性的判断标准。

2 结果

2.1 药物对免疫抑制小鼠体重的影响

连续给药14天后，称量小鼠的最终体重，并分别计算增重率，结果表明，初始体重和最终体重各组间差别不大(P>0.05)，但增重率结果表明，实验导致各组增重情况有所变化，其中空白组平均增重率最高，使用药物后，小鼠体重增长程度较空白组均有不同程度的下降。与模型组相比，使用药物各组体重增长率升高并不明显，其中薏米组甚至稍有下降，但与模型组相比P>0.05,不具有统计学意义。但薏米组增重率与正常组差别明显(P<0.05)。见表1。

2.2 药物对小鼠脏器指数的影响(mg/g)

14天后处死小鼠，取其脾脏、胸腺称重并计算小鼠脏器指数，即器官重比体重。见表2，空白组、模型组、蒲公英组、酸枣仁组、淮山药组、薏米组的脾脏指数分别为5.23±1.04，3.53±0.75， 4.30±0.31，4.82±1.19，5.04±0.61，4.59±0.73；胸腺指数分别为5.24±0.74，1.30±0.40， 1.98±0.31，2.48±0.73，2.15±0.44，2.21±0.69。与正常空白组比较，模型组小鼠的脾脏和胸腺指数显著降低(P<0.05)，差异有统计学意义，说明造模成功。各组的脾脏和胸腺指数均有所上升。与模型组比较，只有淮山药组差异显著(P<0.05)，明显恢复，接近正常水平，但所有实验组小鼠与正常组比较，差异并不明显(P>0.05)。酸枣仁、淮山药、薏米组相比模型组胸腺指数有明显恢复(P<0.05)，尽管酸枣仁组指数最高，但与正常组相比，差异显著(P<0.05)，仍未恢复到正常水平。说明给药后，4组药物对脾脏和胸腺均有不同程度的积极作用，但胸腺指数仍未恢复到正常水平。

表1 4种中药对小鼠体重的影响

注：a表示与空白组比较，P<0.05；b表示与模型组比较，P<0.05；c表示与蒲公英组比较，P<0.05；d表示与酸枣仁组比较，P<0.05；e表示与淮山药组比较，P<0.05。下表同。

表2 4种中药对小鼠主要器官重量的影响

2.3 药物对小鼠体液免疫的影响

2.3.1血清溶血素检测 给药第11天，腹腔注射5% CRBC，末次给药24 h后，摘眼球取血，检测计算，数据见表3。空白组、模型组、蒲公英组、酸枣仁组、淮山药组、薏米组的半数溶血值分别为72.96±5.90、49.72±0.76、53.64±7.67、56.01±5.85、59.99±9.04、59.78±9.78、63.16±6.37。与模型组相比，各组的半数溶血值均有提高，高于模型组，但差异不显著(P>0.05)，其中薏米组对于提高半数溶血值效果最好，接近空白组，与正常小鼠差异不显著(P>0.05)，接近正常水平。

2.3.2血清免疫球蛋白和细胞因子检测 末次给药12 h后，取血，ELISA试剂盒检测血清中IgG、IL-12、IFN-γ含量，数据见表4。空白组、模型组、蒲公英组、酸枣仁组、淮山药组、薏米组的测得IgG含量分别为29.51±6.22、16.82±5.53、44.29±8.20、35.98±13.22、34.42±6.81。4个中药实验组的IgG水平显著高于空白对照组(P<0.05)，表明几种中药均能提高免疫抑制小鼠免疫功能。其中蒲公英组与薏米组相比空白组增多最明显(P<0.05)，表明其改善体液免疫作用显著。

表3 4种中药对小鼠血清溶血素的影响

IL-12的检测结果为91.75±7.93、77.85±2.22、98.32±22.86、82.26±6.25、91.94±6.35、98.49±5.17。IFN-γ的检测结果为712.13±76.60、545.79±33.21、654.60±32.07、556.41±81.51、658.44±78.40、674.65±96.55。各组IL-12和IFN-γ的含量水平检测具有相近趋势。模型组和空白组相比，IL-12和IFN-γ的结果都有显著差异(P<0.05)，与模型组相比，蒲公英、淮山药、薏米组的IL-12和IFN-γ均有显著增多(P<0.05)，其中薏米组在IL-12和IFN-γ的血清含量检测中皆为最佳。可见4种中药在促进小鼠体液免疫抗体分泌反面，有各自不同作用。

表4 4种中药对小鼠血清IgG、IL-12、IFN-γ含量的影响

2.4 药物对小鼠细胞免疫的影响

脾淋巴细胞增殖转化实验结果见表5，空白组、模型组、蒲公英组、酸枣仁组、淮山药组、薏米组的增值刺激指数分别为1.83±0.75、1.00±0.12、1.48±0.44、1.09±0.09、1.34±0.37、1.11±0.10。除酸枣仁组，其余各组的增值刺激指数均升高，其中蒲公英组最高，为1.48±0.44，其次为淮山药组，为1.34±0.37，表明蒲公英组和淮山药组小鼠细胞免疫水平得到明显提高，较接近正常空白组(P>0.05)。

表5 4种中药对小鼠淋巴细胞增殖的影响

2.5 药物对小鼠吞噬细胞功能的影响

最后1次给药后，腹腔注射鸡红细胞悬液，腹腔液涂片计算吞噬率和吞噬指数见表6。空白组、模型组、蒲公英组、酸枣仁组、淮山药组、薏米组的吞噬率分别为39.33±1.15、11.50±0.71、23.35±0.71、33.46±2.12、39.61±4.94、32.51±3.36；吞噬指数分别为0.42±0.19、0.14±0.06、0.38±0.04、0.32±0.10、0.43±0.12、0.37±0.12。与模型组相比，各组的吞噬率显著提高(P<0.05)，吞噬指数也均不同程度升高，其中淮山药组的吞噬率和吞噬指数升高最多，与模型组有显著差异(P<0.05)，且都超过了正常水平，表明淮山药组在提高吞噬细胞功能上效果显著。

表6 4种中药对小鼠吞噬功能的影响

3 讨论

本实验以环磷酰胺构建小鼠免疫抑制模型，探究小鼠灌胃蒲公英、酸枣仁、淮山药、薏米4种药食同源中药的免疫调节作用。注射环磷酰胺后，小鼠的脏器比重、体液免疫、细胞免疫及吞噬作用等各项检测结果均显著低于正常小鼠(P<0.05)，使小鼠处于免疫抑制状态。

使用药物后，小鼠体重增长程度较空白组均有不同程度的下降。与模型组相比，使用药物各组体重增长率升高并不明显，其中薏米组甚至稍有下降，利用统计学方法分析P值<0.05，不具有统计学意义。

包括脾脏、胸腺等在内的免疫器官是多种免疫细胞增殖、分化和成熟的场所，免疫器官指数可作为判断免疫器官发育和机体免疫状态的初步指标[8]。脾脏作为人体外周最大器官，是淋巴细胞接受抗原刺激并产生免疫反应的重要场所[9]。本实验结果显示，药物对脾脏指数均有所恢复，淮山药组的脾脏指数有明显恢复(P<0.05)，表明淮山药组对于脾脏淋巴细胞增殖活化最为明显。胸腺是T细胞成熟、分化的场所，主要介导细胞免疫[10]，数据显示，酸枣仁、淮山药、薏米组相比模型组胸腺指数有显著恢复(P<0.05)但与正常组相比，仍未恢复到正常水平。与模型组相比，表明中药对促进免疫抑制小鼠免疫器官的发育具有较好的效果。

检测机体红细胞溶血过程中血红蛋白的量可以反映抗体产生水平，进而代表机体的体液免疫水平[11]。与模型组相比，四组血清溶血素水平均有不同程度的升高，其中薏米组的血清溶血素水平升高最多，接近正常，与空白小鼠无显著差异(P>0.05)，表明薏米组可以提高小鼠外周血的抗体生成率，增强体液免疫。但几种药未达到相对模型组十分显著的提高效果(P>0.05)。IgG是血液里含量最高的免疫球蛋白，在抗体介导的防卫机制中发挥重要作用，对体液免疫至关重要[12]。各组相对模型组均显著提高。IL-12具有刺激活化型T细胞增殖和诱发Th0细胞向Th1辅助细胞分化，标志性的分泌IFN-γ、TNF-α等，并能诱导CTL和NK细胞毒性，有抗肿瘤的积极作用。IFN-γ能增强Th1细胞的活性，对巨噬细胞、淋巴细胞、NK细胞等有重要的免疫调节作用。薏米组的IL-12和IFN-γ两项检测结果均显示比模型组显著的提高，推测其可能促进Th1细胞的活性，增强细胞免疫功能。

有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)可诱导脾T淋巴细胞增殖，用以测定淋巴细胞的免疫应答功能。淋巴转移实验结果除酸枣仁组外，其他三组均对增殖有所提高，但不显著，其中蒲公英组和淮山药组结果显示能刺激产生更多的淋巴细胞，表示其增强机体细胞免疫功能较好，有趋近正常趋势。

吞噬作用可评估动物的非特异性免疫状态。巨噬细胞吞噬作用是最重要的，可防御所有类型的入侵细胞，还可通过分泌细胞因子和处理呈递抗原，间接发挥作用从而调节免疫系统。与模型组相比，四种中药组小鼠吞噬率、吞噬指数均明显上升，其中淮山药组吞噬率、吞噬指数上升最明显均超过空白组。结果表明这四种中药均能增强腹腔巨噬细胞的吞噬作用，并且淮山药的增强作用最明显。

本实验采取的4种中药：蒲公英、酸枣仁、淮山药、薏米均为药食同源物品，在生活中食用较为广泛。以灌胃的方式作用在环磷酰胺抑制的小鼠模型中，发现其对免疫器官指数、特异性的体液免疫和细胞免疫，非特异性的吞噬功能均有不同程度的提高。淮山药在脾脏指数、细胞免疫、吞噬等调节作用中均为相对最佳，而薏米在体液免疫的促进溶血素和多种免疫细胞因子分泌的中也有相对最好效果，蒲公英、酸枣仁均有各自不同免疫调节作用。综合各项指标，淮山药的免疫调节相对更全面和显著。实验对在免疫调节的临床应用上，可根据不同需求选用中药调节免疫低下疾病，或者在肿瘤放疗、化疗患者作为辅助治疗药物或辅食增强免疫力有参考价值。