张维杰 汪 杨 王国强 金春杰

（1 吉林省人民医院感染科，吉林 长春 130021；2 吉林大学第一医院感染科，吉林 长春 130021；3 吉林大学基础医学部病原生物学系，吉林 长春 130021）

肺炎克雷伯菌属于一种常见的感染病菌，其属于革兰阴性杆菌，容易在患者的呼吸道与肠道进行定植[1]，从而导致患者血液、呼吸道、泌尿道、手术切口、颅内等多部分感染[2]。属于院内感染的常见病菌，同时也是一种耐药菌。在医院的临床标本检测当中，分离到了很多泛耐药性的肠杆菌科细菌，如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等。而这些耐药菌株会产生超广谱β内酰胺酶以及青霉烯酶，并且还容易导致抗生素的活性下降[3]，进而产生耐药性，在临床治疗中药物疗效受到显著影响，特别是对于KPC型碳青霉烯酶而言，甚至可以通过质粒介导传播，其传播速度非常快，并且具有广泛的耐药谱，病菌流行较快。本次研究特对本院KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌进行检测，分析其具体检测方法以及耐药性。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本次研究中菌株来源为本院分离的耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，菌株选取量为50例，研究时间从2016年1月1日至2018年9月1日。菌株鉴定方法采用药敏试验，检测仪器为法国梅里埃生物技术公司生产的全自动细菌鉴定药敏系统。PCR检测采用德国Eppendorf公司的PCR仪，美国Syngene公司生产的凝胶成像系统。德国Eppendorf公司生产的高速离心机。抗菌药物试纸由Oxoid公司提供。

1.2 方法：①分离菌株：在本院各科室收集不同类型标本进程培养，在培养完成后采用氧化酶试验、革兰染色实验操作，根据试验结果选择革兰阴性菌卡片，采用全自动微生物鉴定仪进行菌种鉴定，将霍氏肠杆菌与嗜麦芽窄食单胞菌作为质控菌株。②药敏试验：对50株耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌采用药敏试验，采用K-B法进行药敏试验，对阿米卡星、头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢替坦、复方磺胺甲恶唑、哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、氨曲南等药物进行耐药性分析。③Hodge试验：采用K-B法进行常规药敏试验，并且对患者接种大肠埃希菌ATCC25922，通过生理盐水的方式制备0.5麦氏单位标准的菌悬液M-H平板，后放置5 min进行干燥，干燥完成后放置在厄他培南纸片上，厄他培南剂量为10 μg，使接种在血平板上生长一夜，取纸片边缘向外画直线的10 μL接种环，划线长度在25 mm以上，采用阴性阳性对照的方式，观察抑菌环与测菌株交叉处是否存在增强生长的情况。④PCR检测：制备模板DNA，采用煮沸裂解法进行制备，将KPC阳性菌株作为对照，将ATCC700603作为阴性对照。

1.3 观察标准：①KPC阳性菌株阳性率（PCR检测、Hodge试验）、②不同药物耐药性分析（阿米卡星、头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢替坦、复方磺胺甲恶唑、哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、氨曲南）。

2 结果

2.1 KPC阳性菌株阳性率：从50例耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株的检测情况上看，在Hodge试验中，其中KPC阳性菌株41例，阳性率为82.0%；在PCR检测中，检测出KPC阳性菌株43例，阳性率为86.0%。

2.2 不同药物耐药性分析：从药敏试验上看，其中对于头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟等药物耐药率为100%，对于头孢他啶的耐药性为96.0%，对于头孢吡肟的耐药率为90.0%，对于头孢替坦的耐药率为84.0%、对于复方磺胺甲恶唑的耐药率为90.0%，对于哌拉西林他唑巴坦的耐药率为72.0%，对于左氧氟沙星的耐药率为64.0%，环丙沙星的耐药率为64.0%，对于阿莫西林的耐药率为88.0%，对于氨曲南的耐药率为96.0%，对于对于阿米卡星药物耐药率最低，为40.0%。见表1。

表1 50例菌株对于不同药物耐药性分析

3 讨论

KPC酶首次发现是在美国的1例肺炎克雷伯菌当中分离到的，这种病菌对于美罗培南药物具有较高的耐药性，属于碳青霉烯Ambler分类当中的一类[4]，这种酶的结构特征比较类似于碳氢霉烯酶，根据临床研究表明，KPC酶几乎可以对所有的β内酰胺类抗菌药物进行水解，但是对于头霉素而言不能水解[5]。

肺炎克雷伯菌属于一种常见的感染病菌，其属于革兰阴性杆菌，容易在患者的呼吸道与肠道进行定植，从而导致患者血液、呼吸道、泌尿道、手术切口、颅内等多部分感染。碳青霉烯类抗菌药物目前是抗菌谱最广[6]，并且抗菌活性最强的一种抗菌药物，因此在临床上将碳青霉烯酶作为多耐药菌感染疾病的主要治疗抗菌药物，在本次研究当中，头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、复方磺胺甲恶唑、氨曲南等药物的耐药率均在90%～100%，而阿米卡星药物的耐药率为40%，左氧氟沙星与环丙沙星的耐药率均为64.0%，符合临床大部分报道。另外，随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的广泛应用，因此这类抗菌药物的耐药药物检出率也越来越高，在临床治疗中，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的药理机制主要为Ampc酶，而KPC酶属于Bush类，克拉维酸对于这种酶均有显著的活性抑制作用，从目前的KPC酶来看，已经检测出的具有多种类型，在本次实验当中，没有采用不同类型的KPC酶作为引物，对于其耐药机制有待进一步研究[7]。

碳青霉烯酶的基因主要在可转移性的质粒上，并且可以利用多种基因元件作为传播的介导，因此多种耐药菌株的传播性比较强，对于临床治疗当中，为了缩短患者的治疗周期，同时避免滥用抗菌药物的情况发生，需要对碳青霉烯酶的菌株进行耐药性分析[8]。为了有效的避免耐药菌在医院内部传播与流行，需要采用严格的控制感染方案[9]。

抗菌药物的运用会导致耐药菌株的出现，而这些耐药菌株会产生超广谱β内酰胺酶以及青霉烯酶，并且还容易导致抗生素的活性下降，进而产生耐药性，影响临床治疗效果[10]。从国内抗菌药物运用情况上分析，各种抗菌药物的滥用导致耐药菌株出现，因此需要预防更多的耐药菌株出现，需要采用科学合理的药物治疗方案。同时还需要扩大药敏试验的药物种类，避免出现无药可用的情况。从目前的情况来看，超广谱抗菌药物的耐药菌越来越多，导致抗菌药物的滥用[11]，进而导致碳青霉烯菌在世界范围内流行。从肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的种类来看，其中A类:丝氨酸碳青霉烯酶主要包含了（IMI酶GES酶）KPC酶、SME酶，而B类：金属β-内酰胺酶则主要包括了NDM、VIM、IMP、GIM、SPM，而这种类型的酶一般存在非发酵菌当中，在我国肠杆菌科细菌种B类少见（肠杆菌科比较罕见）。KPC酶最早发现于美国，并且在美国较为多见，在本世纪初，我国浙江大学医学院附属医院在临床上分离出了KPC酶的肺炎克雷伯菌，同时也是我国首次分离出KPC酶，由此可见，KPC酶肺炎克雷伯菌再也不是地区性的病菌传播，而是世界性的感染病菌，这种病菌发生的主要因素是由青霉烯类抗菌的滥用引起的耐药突变。

在本次研究当中，从50例耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株的检测情况上看，在Hodge试验中，其中KPC阳性菌株41例，阳性率为82.0%；在PCR检测中，检测出KPC阳性菌株43例，阳性率为86.0%。

从药敏试验上看，其中对于头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟等药物耐药率为100%，对于头孢他啶的耐药性为96.0%，对于头孢吡肟的耐药率为90.0%，对于头孢替坦的耐药率为84.0%、对于复方磺胺甲恶唑的耐药率为90.0%，对于哌拉西林他唑巴坦的耐药率为72.0%，对于左氧氟沙星的耐药率为64.0%，环丙沙星的耐药率为64.0%，对于阿莫西林的耐药率为88.0%，对于氨曲南的耐药率为96.0%，对于对于阿米卡星药物耐药率最低为40.0%。临床治疗耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的药物可选择的不多：常用的是以替加环素、多粘菌素为基础的联合治疗，备选药物有：碳青霉烯、磷霉素、氨基糖苷、氨曲南、环丙沙星等少数药物，即将上市的头孢他啶/阿维巴坦对产KPC酶的肺炎克雷伯菌临床观察疗效较好，值得期待。

综上所述，在近3年2家相邻医院50例耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株当中，发现了KPC阳性菌株，并且该病菌对于不同药物的临床耐药性不同，对于头孢类药物耐药率较高，具体耐药性还需要进一步检测。在临床治疗中，医师需要慎重选择抗生素治疗，并且加强临床抗菌药物监控，避免抗菌药物滥用。