木素脱氢聚合物-葡萄糖复合体形成机理的研究

2020-05-28谢益民刘雁超

中国造纸 2020年4期

谢益民蒋晨刘雁超

（1.湖北工业大学制浆造纸研究院，湖北武汉，430068；2.湖北工业大学绿色轻工材料湖北省重点实验室，湖北武汉，430068）

在制浆造纸工业、黏胶纤维工业[1-2]以及生物精炼过程中，需要最大限度从植物细胞壁中分离出纤维素，提高植物原料的利用率。大量研究[3-4]证实了植物体内木素与碳水化合物（纤维素和半纤维素）之间是有化学键连接的，主要与半纤维素间有大量的键结合，也有部分与纤维素连接，一般认为木素-碳水化合物复合体（LCC）之间的连接键为：苯甲醚键、糖醛酸苯甲酯键、苯基糖苷键、木素侧链上的糖苷键和缩醛键等。而聚葡萄糖-木素复合体[5-8]的存在严重阻碍了制浆过程中木素的完全脱除，影响了纸浆的得率以及纸浆在深度脱木素过程中的效率[9-13]。因此聚葡萄糖-木素复合体中化学结构的解析及其降解特性的研究是制浆造纸领域和木材化学一个重要的研究方向。

20世纪90年代，Karlsson等人[5]利用色谱的方法确认了松木硫酸盐浆里有非常牢固的木素-纤维素化学键。Isogai A[14]在研究高纯度黏胶纤维时发现，反复的精制处理也不能获得纯的纤维素，通常伴随着甘露糖、木糖等半纤维素组分，也含有木素组分，认为木素有可能与纤维素的C6之间存在化学键的连接。部分研究者[15-17]认为，比较无序的纤维素无定形区可能与木素有化学键的结合。Oinonen P 等人[18]的研究小组对纤维素-木素复合体做了大量的研究，认为纤维素微细纤维束及由木素和半纤维素构成的matrix 之间的界面上，存在木素侧链Cα和纤维素之间的共价键的连接。Zhou Y 等人[19]使用天然丰度稳定同位素比值（18O/16O 比值）分析植物细胞壁纤维素和木素之间的化学键，提出了一个更详细的纤维素-木素复合体模型，认为木素和纤维素之间存在γ-酯键和α-醚键的连接。也有研究者[20-21]提出纤维素和木素之间的连接键除了上述两种外，还有可能存在苯基糖苷键。

为了更直观研究纤维素和木素之间的化学连接，研究人员对植物体外合成木素-碳水化合物模型物进行了大量探索[22-23]。Freudenberg 等人[24-25]通过在浓厚的蔗糖溶液中滴加松柏醇及木素氧化酶，证实了松柏醇脱氢聚合反应中有木素-碳水化合物复合体形成的可能性。苏琪等人[26]研究了在微晶纤维素存在下，木素脱氢聚合物-纤维素复合物（DHPCC）的生物合成，发现在二氯乙烷-乙醇混合液和8 mol/L 尿素溶液的溶解处理下，也不能完全去除DHP 部分，得出在木素脱氢聚合物形成的过程中能与纤维素产生牢固化学键连接的结果。顾瑞军等人[27]合成了侧链α位带13C标记的木素前驱物松柏醇-β-D-葡萄糖苷，模拟木素生物合成过程，得到带13C 标记的DHP-综纤维素复合物（DHPHC），研究发现木素苯丙烷结构单元的Cα与碳水化合物间的化学连接键主要是醚键和酯键。总之，大量研究已经证实植物原料中碳水化合物和木素间存在化学键的连接，但是聚葡萄糖-木素间化学键的证据依然不足，仍需进一步探讨。

本研究首先探讨了在C6位带13C 同位素标记的（6-13C）葡萄糖存在下，松柏醇葡萄糖苷利用过氧化物酶的催化作用，合成DHP-（6-13C）葡萄糖的聚合物，采用13C NMR 分析木素侧链与葡萄糖C6位之间连接键的形成。在此基础上，进一步分析在纤维二糖的存在下，松柏醇葡萄糖苷的过氧化物酶催化脱氢聚合，得到了DHP-纤维二糖复合体，通过13C NMR 分析纤维二糖与DHP 之间化学键的连接，从而进一步验证聚葡萄糖与木素之间的连接方式。

1 实验

1.1 试剂及仪器

松柏醇-β-D-葡萄糖苷（实验室合成）；葡萄糖氧化酶（15500 units/g，Ⅱ型，来自黑曲霉，购自美国Sigma 公司）；β-葡萄糖甙酶（6.3 U/mg,来自杏仁，购自美国Fluka 公司）；过氧化物酶（158 purpurogallin units/mg，Ⅱ型，来自辣根，购自美国Sigma 公司）；葡萄糖、乙酸钠、乙酸、无水乙醚等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶液的配制：500 mg 松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶解在50 mL 的0.2 mol/L 乙酸/乙酸钠的缓冲溶液（pH值=4.9），适当的加热溶解，冷却并用0.45 μm的微孔滤膜过滤，放置常温备用。

Avance-400 傅里叶超导核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；K-16 大容量冷冻式离心机（美国Sigma 公司）；6700 型傅里叶红外光谱仪（FT-IR，美国Thermofisher Nicolet 公司）；DIF-6020 型真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司）。

1.2 DHP-葡萄糖复合体的制备

采用顾瑞军等人[27]改进的方法合成DHP-葡萄糖复合体，具体步骤为：将1.32 g 葡萄糖溶解在50 mL 0.2 mol/L 乙酸/乙酸钠的缓冲溶液（pH 值=4.9）中，密封存放。在无菌条件下，将葡萄糖氧化酶50.0 mg、β-葡萄糖甙酶44.1 mg、过氧化物酶1.5 mg溶解在3 mL 新鲜的蒸馏水中，溶解好后加入到葡萄糖的缓冲溶液中。在曝气条件下，用恒流泵将500 mg 松柏醇葡萄糖苷溶液在24 h 内逐滴加入到酶与葡萄糖的混合溶液中，滴加完毕后，在30℃的恒温水浴锅中继续反应10 天，且在反应期间不断地通入经过棉花和活性炭过滤后的空气。反应结束后离心分离，用水洗涤不溶物8次，真空干燥后再用无水乙醚清洗3次，真空干燥后得100.3 mg未标记的木素脱氢聚合物-葡萄糖复合物（DHP-葡萄糖复合体）。

取500 mg 松柏醇葡萄糖苷、100 mg (6-13C)葡萄糖，用上述方法合成96 mg 带标记的复合物（DHP-(6-13C)葡萄糖复合体）。

1.3 DHP-纤维二糖复合体的制备

参考合成DHP-葡萄糖复合体的方法[27]，将2.5 g纤维二糖溶解在50 mL 0.2 mol/L 乙酸/乙酸钠的缓冲溶液（pH 值=4.9）中。在无菌条件下，将葡萄糖氧化酶50.0 mg、β-葡萄糖甙酶44.1 mg、过氧化物酶1.5 mg 溶解在3 mL 新鲜的蒸馏水中，溶解好后加入到纤维二糖的缓冲溶液中。在曝气条件下，用恒流泵将500 mg 松柏醇葡萄糖苷溶液在24 h 内逐滴加入到酶与纤维二糖的混合溶液中，滴加完毕后，在30℃的恒温水浴锅中继续反应10 天，且在反应期间不断地通入经过棉花和活性炭过滤的空气。反应结束后离心分离，用水洗涤不溶物8 次，真空干燥后得80 mg 木素脱氢聚合物-纤维素二糖复合物。

1.4 红外光谱表征

取约2 mg 样品与10 倍量的无水KBr 混合，混合均匀后，倒入压片模具中压片，采用傅里叶变换红外光谱仪用透过法测定红外光谱图。

1.5 液态13C NMR谱图的测定

液态13C NMR 谱图采用华中科技大学的Bruker AV400 型核磁共振仪进行测定。将约100 mg 样品溶于0.6 mL DMSO-d6中，用φ5 mm 样品管。实验条件：扫描频率100 MHz，25℃，脉冲信号30°，延迟时间3 s，扫描次数20000次。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图1 为DHP-葡萄糖复合体和DHP-(6-13C)葡萄糖复合体的红外光谱图。从图1 可以看出，3427.3、3428.2 cm-1处的吸收峰为羟基的吸收峰。在1602.0、1510.4 cm-1及1413.3 cm-1处的吸收峰说明了该产物中有苯环结构存在[28]，由此可知产物中有木素结构。1035.8、1082.4 cm-1的吸收峰为葡萄糖结构上C—O键的伸缩振动[11]，说明聚合物中含有一定量的聚葡萄糖。由以上的分析可以推断出葡萄糖与木素之间确实有化学键连接。要深入了解DHP 与葡萄糖之间具体的化学连接方式，还需要通过13C NMR 进行进一步分析。

图1 DHP-葡萄糖复合体和DHP-(6-13C)葡萄糖复合体的FT-IR图

2.2 高分辨率液态13C NMR分析

图2 DHP-葡萄糖复合体和DHP-(6-13C)葡萄糖复合体的13C NMR谱图

图2 为DHP-葡萄糖复合体和DHP-(6-13C)葡萄糖复合体的13C NMR 谱图。根据前人对木素的13C NMR谱图的分析结果[29-32]，本研究对图2 中的共振信号进行了归属，结果见表1。分析得到的木素结构单元间连接方式如图3 所示。以δ=56.04 处甲氧基的共振峰作为基准，由分析可知δ为176.65 (No.1)、174.89(No.2)处均为阿魏酸及其衍生物的羰基的共振信号(结构见图3(Ⅰ)、图3(Ⅱ))。δ=147.58(No.3)是醚化的愈创木基中的C3，δ=144.12 (No.5)处是醚化的5-5’结构(见图3(Ⅳ))中的C4/C4’，δ=132.26(No.6)处为愈创木基中的C1，δ为129.70(No.8)和128.44(No.9)处均为松柏醇结构中的Cα和Cβ(见图3(Ⅰ))上的振动信号，δ为119.40(No.10)～110.22(No.12)处分别为愈创木基中C6、C5、C2上的振动峰，上述吸收峰的强度都比较高，说明了DHP-葡萄糖复合体中芳香族结构所占的比例比较高。δ为100.34 (No.13)处为葡萄糖上的C1的振动峰，δ为87.53 (No.15)处的信号峰为β-5 结构(见图3(Ⅵ))中的Cα和Cβ的共振吸收峰。δ为85.50(No.16)处是β-β结构(见图3(Ⅶ))中Cα的吸收峰。δ为71.12 (No.21)处是葡萄糖上C2的振动峰，δ为73.58(No.18)处为葡萄糖上C3的振动吸收峰，δ为70.17(No.22)处为葡萄糖上C4的振动峰，δ为71.91(No.20)处为葡萄糖上C5的振动峰，δ为61.99(No.24)处为葡萄糖C6的峰，DHP-(6-13C)葡萄糖复合体较DHP-葡萄糖复合体有很明显的增强，说明复合体中的葡萄糖C6被13C 同位素标记，此处还有愈创木基β-O-4 结构(见图3(Ⅲ))中Cγ的峰。δ为72.70 (No.19)处的吸收峰，两种复合体谱图相比较可发现DHP-(6-13C) 葡萄糖复合体峰有明显的增强。根据Azuma J 等人[33]对纤维素及其相关碳水化合物的核磁研究表明纤维素C6位上的碳有醚键存在时，纤维素C6峰的化学位移向低场迁移到δ为72.6。根据Xie Y 等人[34]的研究结果，木质素苯丙烷结构上只有Cα上才有醚键型LCC 连接键的存在，由此可知，δ为72.70处的峰为与β-O-4结构中Cα有醚键连接的纤维素C6位上的碳原子的共振信号。该结果与向松明等人[22-23]对银杏中的纤维素的13C同位素示踪所得到的结果一致(见图3(Ⅴ))。

表1 DHP-葡萄糖复合体和DHP-(6-13C)葡萄糖复合体的13C NMR 分析

由DHP 和葡萄糖的过氧化物酶催化聚合实验以及13C NMR的结果分析可知，DHP-葡萄糖复合体中存在的木素结构包括β-β、β-O-4 和β-5，同时还包含少部分的阿魏酸结构。通过带13C 标记的葡萄糖与DHP聚合，得到的聚合物DHP-(6-13C)葡萄糖复合体的13C NMR 与不带同位素标记的DHP-葡萄糖复合体对比分析可知，葡萄糖C6上的碳与木素结构是以苯甲醚键连接的。

2.3 纤维二糖存在下DHP 的生物合成产物红外光谱分析

纤维二糖存在下DHP 的生物合成产物（DHP-纤维二糖）的FT-IR 谱图如图4 所示。可以看出3442.63 cm-1为羟基的伸缩振动峰，2892.71 cm-1为甲基、亚甲基及次甲基中C—H 键的伸缩振动，1652.92 cm-1为共轭羰基的伸缩振动，1515.75 及1438.35 cm-1处的吸收峰说明了该产物中有苯环结构存在，由此可知产物中有木素结构存在。1459.17 cm-1为甲基中C—H 键的伸缩振动峰，1384.91 cm-1为芳香核（—OH）振动，1269.24 cm-1为羟基振动和木素中C=O 伸缩振动，1142.48 cm-1为纤维素中羟基的缔合光带，1033.95 cm-1为纤维素中C—O 的伸缩振动，说明有纤维素的存在，至于纤维二糖与木素具体的化学键连接方式，还需要用高分辨率的液态核磁来对产物进行检测分析。

2.4 DHP-纤维二糖复合体的13C NMR波谱分析

为了进一步验证植物体内纤维素C6位与木素侧链Cα之间的醚键连接[22-23]，本实验采用DHP 与纤维二糖聚合形成DHP-纤维二糖复合体，其13C NMR 如图5所示，具体的核磁共振信号的分析结果见表2。δ为194.82(No.1)为松柏醛结构中的γ-CHO 的共振吸收峰，δ为172.54No.2)是DHP里阿魏酸的Cγ的振动峰，δ为149.84(No.3)、148.02(No.4)为愈创木基结构中碳的吸收峰，δ为144.15 (No.5)是醚化了的5-5 结构中C4的吸收峰。δ为132.81(No.6)是愈创木基结构中与丙烷结构相连接的C1的共振信号。δ为129.50(No.7)和128.48(No.8)分别为松柏醇结构中的Cα和Cβ上的振动信号，δ为119.09(No.9)～110.89(No.11)分别为愈创木基中C6、C5、C2上的振动峰，上述吸收峰的强度均比较高，说明了DHP-纤维二糖复合体中有大量的芳香族结构存在。δ为100.82(No.12)处的信号峰是纤维二糖C1的峰，δ为87.69(No.13)处的信号峰为β-5 结构中的Cα共振峰。δ为85.68(No.14)是β-O-4中的Cβ以及β-β结构中Cα的信号，δ为81.55(No.14’)处微弱的信号来自于木素结构单元与糖类有苯甲醚键相连接的Cα[34-35]。δ为72.11～74.56(No.16)的信号归属如下：与纤维二糖上的C2以及与纤维二糖有苯甲酯键连接的木素结构单元的]，与β-O-4 结构中Cα有醚键连接的纤维素6 位上的碳原子的共振信号[22-23]，以及β-O-4 中Cα，纤维二糖上的C2的信号。δ为70.13(No.17)为纤维二糖上的C4的信号峰。δ为63.43（No.18）处的信号来自苯基香豆满的Cγ，β-1 结构中Cα与Cβ。δ为62.12(No.19)处除了有纤维二糖上C6的振动峰以外，还有β-O-4 结构中Cγ的共振吸收峰。