仇俊兰，许丽华，奉 林

（南京医科大学附属苏州科技城医院肿瘤血液科，江苏 苏州 215153）

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）属世界常见恶性肿瘤，我国CRC粗发病率、死亡率均位居前五位，大多数发现时已处于晚期，死亡率呈逐年上升和年轻化趋势[1]，如能早诊、早治可明显延长患者总生存时间，节约社会资源。微小RNA（microRNA, miRNA）是大小22～25 nt的一类内源性非编码RNA分子，在转录后水平一对多或多对一调控靶基因，调节细胞的分化、增殖、凋亡等生物学过程，在肿瘤发展过程中发挥癌基因和抑癌基因的作用[2]。虽然已报道人类有七百多种miRNA，而能完全明确靶基因和功能的miRNA不多，为深入研究miRNA介导的致癌通路，首先须正确鉴定出表达异常的miRNA[3]。本研究通过实时荧光定量PCR（qPCR）测定CRC组和对照组血清miR-29a-3p的表达，分析其表达与临床特征的关系及用于诊断CRC的效能，为寻找CRC早诊、早治和评估预后的生物标记物提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年02月—2019年02月于本院肿瘤血液科就诊的65 例CRC患者，平均年龄为61.60(21～88)岁。其中结肠癌54 例，直肠癌11 例；男性43 例，女性22 例；临床分期Ⅰ-Ⅱ期20 例，Ⅲ-Ⅳ期45 例；高、中分化23 例，低、未分化42 例；癌痛评分0～3 分30 例，4～6 分 20例，7～10 分15 例。所有患者经手术或肠镜病理确诊，否认其他肿瘤病史，近3个月内未接受抗肿瘤治疗。同期选取健康体检志愿者65 名作为对照，平均年龄60.80(22～87)岁，男性40 名，女性25 名，两组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经过医院伦理学委员会批准，入组前须知情同意。

1.2 检测方法 采集肘静脉血2 mL，室温放置30 min，离心后吸取上清，使用mirVanaTMPARISTM试剂盒抽提总RNA，经NanoDrop ND-1000 spectrophotometer仪测定RNA浓度后，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，miScript Reverse Transcription反转录试剂盒进行反转录，PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix试剂盒进行PCR反应，熔解曲线检测产物特异性。血清miR-29a-3p扩增引物为：5'TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-3'，U6 snRNA作为内参照，引物为5'TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3'。引物由上海欧易生物医学科技有限公司提供。PCR反应条件为：预变性95 ℃15 min，（94 ℃15 s，55 ℃30 s，70 ℃34 s），40 个循环。每个miRNA的相对表达量用2－△△Ct表示，其中△Ct＝CtmiRNA－CtU6。以上实验重复3 次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0软件统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示及t检验比较；计数资料采用例数、百分数描述及χ2检验。应用受试者工作特征曲线（ROC curve）下面积（AUC）计算血清miR-29a-3p诊断CRC的效能，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-29a-3p的测定结果 内参基因选用U6，Ct值较高，miR-29a-3p所得熔解曲线为单一峰，PCR扩增特异性较好（熔解曲线及扩增曲线见图1）。CRC患者血清miR-29a-3p相对表达量较对照组升高，差异有统计学意义[(0.251±0.175) vs(0.101±0.027)，P＜0.01]。

图1 miR-29a-3p熔解曲线（A）和扩增曲线（B）

2.2 CRC不同亚组患者血清miR-29a-3p的表达 血清miR-29a-3p表达与临床分期、淋巴结转移有关，差异有统计学意义（P＜0.05）；而不同性别、年龄、分化程度、肿瘤部位与癌痛评分的CRC患者差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 CRC不同亚组患者血清miR-29a-3p的表达水平（±s）

表1 CRC不同亚组患者血清miR-29a-3p的表达水平（±s）

临床特征 n miR-29a-3p表达 P值性别 ＞0.05男43 0.313±0.195女22 0.252±0.150年龄 ＞0.05＜60 岁 29 0.238±0.167≥60 岁 36 0.268±0.188组织分化程度 ＞0.05高、中分化 23 0.229±0.162低、未分化 42 0.291±0.194临床分期 ＜0.05Ⅰ-Ⅱ 20 0.165±0.114Ⅲ-Ⅳ 45 0.313±0.301淋巴结转移 ＜0.05有40 0.301±0.184无25 0.147±0.095肿瘤部位 ＞0.05结肠 54 0.247±0.186直肠 11 0.251±0.119癌痛评分 ＞0.05 0～3 分 30 0.238±0.146 4～6 分 20 0.219±0.101 7～10 分 15 0.317±0.267

2.3 血清miR-29a-3p诊断CRC的效能 在界值为0.104时，血清miR-29a-3p诊断CRC灵敏度（Se）为72.90%，特异度（Sp）为84.80%，假阳性率（FPR）为15.20%，假阴性率（FNR）为27.10%，阳性似然比（LR+）为4.80，阴性似然比（LR-）为0.33，正确诊断指数（YI）为0.577。AUC为0.817，与AUC＝0.5比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），且其介于0.7～0.9，提示有一定的准确性。

3 讨论

CRC的发生是多因素长期作用的结果，存在癌基因、抑癌基因、DNA错配修复基因等功能改变。人类大约30%的基因受miRNA调控，且miRNA可在肿瘤形成的不同阶段出现异常表达，表达下调发挥抑癌基因作用，而表达上调发挥癌基因作用[4]。因此，对某些恶性肿瘤可通过上调或下调不同miRNA达到辅助治疗的作用，例如上调卵巢癌细胞miR-147b表达能加速癌细胞凋亡，增加对卡铂化疗敏感性[5]；上调乳腺癌细胞miRNA-708-3p可抑制癌细胞转移，增强对化疗敏感性[6]；上调miR-29a能抑制前列腺癌细胞的侵袭、转移[7]。

miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，miR-29a包括miR-29a-3p和miR-29a-5p，其中miR-29a-3p定位于7号染色体的q32中，类似于其他的miRNAs，miR-29a具有组织表达差异性，致癌机制复杂，在多数肿瘤组织中表达下调，少数表达上调，在不同组织中表达量及所发挥的作用差异性较大。例如miR-29a增强乳腺癌细胞增殖和上皮间质化[8]，抑制口腔鳞癌细胞凋亡、促进侵袭[9]，抑制黑色素瘤细胞生长、迁移和侵袭[10]，抑制肝癌细胞增殖和转移[11]。然而由于检测方法、标本留取等质控标准不统一，研究结论尚不一致。本研究应用较认可的qPCR测定CRC组、对照组血清miR-29a-3p水平，结果CRC组明显高于对照组（P＜0.01），表达与临床分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），而不同性别、年龄、组织分化程度、肿瘤部位及癌痛评分CRC患者差异无统计学意义（P＞0.05）；在界值为0.104时，血清miR-29a-3p诊断CRC的Se为72.90%，Sp为84.80%，FPR为15.20%，FNR为27.10%，LR+为4.80，LR-为0.33，正确诊断指数YI为0.577。AUC一般在0.5～1.0，如为0.5，说明诊断试验无诊断价值；如介于0.5～0.7，提示有较低的准确性；如介于0.7～0.9，提示有一定的准确性。本研究AUC为0.817，与AUC＝0.5比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），且其介于0.7～0.9，提示有一定的准确性。根据血清miR-29a-3p水平，可有效区分健康人群和CRC患者，鉴别CRC有无淋巴结转移，区别Ⅰ、Ⅱ期分期与Ⅲ、Ⅳ期分期亚组CRC，血清miR-29a-3p表达上调与CRC不良预后相关，与蔡锐文等[12]报道一致，故血清miR-29a-3p有望成为CRC早诊、早治及评估预后的生物标记物。

早期CRC多无症状，伴有症状的患者多为晚期，如何提高CRC早期诊断率非常关键。研究显示，人类乳汁、唾液、尿液、外周血中均存在miRNA，其在血液中相对稳定存在。血清室温放置24 h或反复冻融，miRNA的测定结果未受明显影响，提示血清miRNA具有良好的稳定性；而血浆离心过滤等处理过程中，残余血小板水平差异具有较大影响，血浆miRNA的表达水平是易变的。循环血miRNA表达水平在不同疾病之间、CRC的癌前病变阶段存在差异性，检测准确率较蛋白质标志物高，且异常表达更早出现，利于CRC早期诊断[13]。综上，为鉴别正常人、癌前病变及不同分期CRC之间的精准差异，可以设想：一方面，增加入组结直肠腺瘤型息肉人群，另一方面，通过测定循环血中miRNA水平，为血清miR-29a-3p用于CRC早期诊断的可行性提供依据。

肿瘤差异性的miRNA表达存在重叠性，如CRC血清中miR-30a、miR-92a、miR-28、miR-888等的异常表达，下一步可通过扩大样本量、联合检测多种miRNA等方法深入研究。