李 洁，车玉琴

（中国医科大学附属第四医院神经内科，辽宁 沈阳 110032）

缺血性中风（IS）是世界范围内最常见的脑血管疾病之一，也是严重残疾和死亡的主要原因。吸烟、肥胖、高同型半胱氨酸血症、高血压、糖尿病、高脂血症、感染甚至炎症等多种危险因素都与IS的发生和发展密切相关。尽管在控制脑血管疾病方面取得了长足的进展，但其发病率和患病率仍在继续增加。因此，需要更多的途径探索IS发病机制以提供更好的诊断和治疗。microRNA作为小的非编码RNA分子，在脑血管疾病中发挥了重要作用[1]。以往研究表明了在IS中具有功能的miRNA，包括miR-30a、miR-126、miR-181b和miR-31。此外，研究表明PKD可能为miR-31的靶向基因[2]。PKD1作为PKD家族成员和丝氨酸/苏氨酸激酶参与了神经元应激反应[3]。同时，研究显示JAK/STAT磷酸化的抑制在IFN-γ处理的星形胶质细胞中起到抗炎作用[4]。据报道，JAK/STAT通路与局灶性脑缺血的星形胶质细胞反应有关，这表明JAK/STAT通路可作为IS的潜在治疗选择[5]。根据上述文献，我们可以推断，在IS治疗中，可以应用miR-31调控JAK/STAT3通路，但其机制尚未被探讨。因此，我们旨在通过构建氧-糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）缺血模型，干预其星状胶质细胞内miR-31调控PKD1基因表达，抑制JAK-STAT3信号通路活化介导OGD模型乳小鼠的星状胶质细胞共培养神经元炎症反应以及氧化应激损伤，为脑卒中治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 原代星状胶质细胞和神经元的提取及细胞分选 取24 h内新生乳小鼠（武汉云克隆科技股份有限公司），75%医用酒精消毒，剪下乳鼠大脑，剔除软脑膜及血管后取大脑皮质，剪成小块后加入5 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化15 min。终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，离心除去细胞碎片；加入一抗GFAP（1:100，ab4674，Abcam）、神经元标志蛋白MAP-2（ab32454，1:100，Abcam，上海），混匀，4 ℃反应30 min，4 ℃含5%胎牛血清的PBS洗涤2 次，加入FITC标记的二抗（1:500），混匀，4 ℃反应30 min。用流式细胞仪分选出乳小鼠大脑皮层中星状胶质细胞（GFAP阳性）和神经元（MAP-2阳性）。

1.2 OGD缺血模型构建和转染 收集流式细胞仪分选的星状胶质细胞，以5×105个/cm2接种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，无血清DMEM/F12培养基培养细胞，置于37 ℃、5% CO2的培养箱37 ℃培养，用于后续实验。收集流式细胞仪分选的神经元，接种于Transwell外孔中，5% CO2、95% O2混合气体的37 ℃饱和湿度培养箱内，Neurobasal培养基（含有2% B27和2 mmol/L L-谷氨酰胺）培养，每3 d换半液。星形胶质细胞分为blank组（空白）、NC组（转染阴性质粒）、miR-31 mimic组（转染miR-31 mimic）、miR-31 inhibitor组（转染miR-31 inhibitor）、si-PKD1组（转染siRNA-PKD1）和si-PKD1＋CdCl2组（转染siRNA-PKD1＋JAK-STAT3抑制剂10 μmol/L CdCl2处理4 h）。

OGD建模星状胶质细胞和神经元共培养：Transwell为双层培养皿，其间为0.4 μm的聚碳酸酯膜，细胞不能自由通过聚碳酸酯膜，但细胞因子及其他信号分子可自由通过此膜。将星状胶质细胞传代接种于Transwell内孔中，置于已接种神经元的Transwell外孔上，将培养基更换为无糖培养基，放入通有混合气体（5% CO2，2% O2和93% N2）、37℃的低氧培养箱60 min后取出，转入37 ℃、5% CO2饱和常氧培养箱，完全培养基继续培养24 h，模拟体内缺血再灌注损伤。OGD建模后将转染的星状胶质细胞与神经元共培养并分组为：normal组（神经元＋星状胶质细胞），blank OGD组（神经元＋星状胶质细胞共培养后OGD建模）、NC OGD组（神经元＋转染阴性质粒星状胶质细胞共培养后OGD建模）、miR-31 mimic OGD组（神经元＋转染miR-31 mimic星状胶质细胞共培养后OGD建模）、miR-31 inhibitor OGD组（神经元＋转染miR-31 inhibitor星状胶质细胞共培养后OGD建模）、si-PKD1 OGD组（神经元＋转染si-PKD1星状胶质细胞共培养后OGD建模）和si-PKD1＋CdCl2OGD组（神经元＋转染siRNA-PKD1并用JAK-STAT3抑制剂10 μmol/L CdCl2处理4 h的星状胶质细胞共培养后OGD建模）。

1.3 MTT法检测OGD共培养体系中神经元存活率 转染后细胞生长密度达到80%左右时，PBS液洗2遍，0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液。计数后，以每孔3×103～6×103个细胞接种于96孔板中，每孔体积0.2 mL，重复6 孔，培养箱孵育，分别于培养24 h、48 h、72 h时取出培养板，换含10% MTT溶液（5 g/L）（GD-Y1317，古朵生物科技公司，上海）的培养基，继续培养4 h，吸掉上清液，每孔加100 μL二甲基亚砜（DMSO）（D5879-100ML，Sigma，USA），轻轻振荡混匀10 min，使其充分溶解由活细胞产生的甲瓒晶体，于酶标仪 （南京德铁实验设备有限公司）检测490 nm处各孔吸光度值，计算细胞存活率，OGD组细胞存活率（%）＝OGD组吸光度值/对照组吸光度值×100%，以对照组的细胞存活率为100%作为对比。

1.4 乳酸脱氢酶（LDH）漏出率测定OGD共培养体系中神经元细胞损伤 OGD会造成神经元细胞的损伤，细胞膜被破坏，通透性增加，细胞浆内的LDH释放到培养基中。因此，测定培养液中LDH的活性，被用于测定细胞的损伤。采用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）进行LDH的测定。经1 h OGD处理，加入15 μL裂解液（9% Triton®X-100溶于水）在37 ℃培养箱孵育45 min；从中取出50 μL细胞上清液至另一个提前加入配制好的底物混合物（50 μL）96孔板中，室温下反应30 min，注意避光；每孔加50 μL终止液来终止酶反应，最后使用酶标仪在490 nm测量吸光值。

1.5 ELISA检测OGD共培养体系中炎症因子 细胞实验中吸取细胞培养上清液，用无菌管收集，2 500 r/min离心20 min，仔细收集上清。按照ELISA试剂盒说明书操作步骤测定细胞培养基中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量。每组实验重复3 次。炎症因子表达水平以pg/mL蛋白质表达。

1.6 荧光探针法检测OGD共培养体系中ROS含量接种于96孔板中的神经元经实验处理后，用含10 μmol/L DCFH-DA荧光探针的培养液于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次以去除探针。用自动酶标检测仪检测细胞内二氯荧光黄（DCF）的荧光强度而测得细胞内活性氧水平，激发波长488 nm，发射波长525 nm。

1.7 TUNEL法检测OGD共培养体系中神经元凋亡将OGD共培养细胞制备密度为5×107个/mL的细胞悬液，取100 μL涂片，放入二甲苯中进行常规脱蜡，随后放入梯度乙醇中水化；滴加0.3% H2O2-甲醇溶液于切片上封闭内源性过氧化物酶（室温，30 min）。TBS洗涂2 次，每次5 min；用滤纸吸干组织周围水分，滴加蛋白酶K工作液，37 ℃孵育30 min。恢复至室温后，TBS洗涂2 次，每次5 min；置于0.1% TritonX-100，0.1%枸橼酸钠溶液中，室温下浸泡5 min。双蒸水洗片2 次，每次5 min；用滤纸吸干标本周围多余水分，滴加TUNEL反应混合物，37 ℃孵育90 min。恢复至室温后，TBS洗涂2次，每次5 min。用滤纸吸干标本周围多余水分，滴加正常山羊血清，室温下封闭20 min。弃去血清，加入转化的POD溶液，37 ℃下放置30 min。恢复至室湿后，TBS洗涂2 次，每次5 min；用滤纸吸干标本周围水分，滴加0.3% H2O2-0.05% DAB显色液，待阳性细胞核染色成棕黄色，用双蒸水冲洗，终止反应。神经元TUNEL染色在滴加TUNEL溶液后，在暗室中于37 ℃温育90 min后PBS洗涤5 min×3次，用DAPI染核5 min，用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察。在400倍显微镜下计数细胞数，每张片随机选择5 个视野。光镜下观察细胞凋亡情况。光镜下计算凋亡率，计算方法：取5 个高倍镜视野，分别计数总细胞数和凋亡细胞数，凋亡率（%）＝(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.8 免疫荧光法检测OGD共培养体系中氧化应激损伤相关蛋白4-HNE和8-OHdG表达 细胞爬片上加入一抗4-HNE（1:500，ab46545，Abcam）或8-OHdG（1:500，ab62623，Abcam）4 ℃孵育过夜，PBS洗5 min×3 次，加FITC标记二抗（1:400）室温孵育2 h（避光），清洗，封片，即可于激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。各组实验独立重复3 次。

1.9 硫代巴比妥酸（TBA）法检测OGD共培养体系中MDA含量 收集OGD 1 h，再恢复24 h后共培养细胞悬液100 μL，利用过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰的原理，严格按照试剂盒说明书测定共培养体系中MDA含量，MDA含量单位为nmol/mgprot。

1.10 黄嘌呤氧化酶法检测OGD共培养体系中SOD含量 收集OGD 1 h，再恢复24 h后，共培养细胞悬液100 μL，利用机体通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺生成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，可通过分光光度计测定其光密度值，当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一抑制作用，形成的亚硝酸盐减少的原理，取共培养细胞悬液，严格按照试剂盒说明书测定共培养体系内SOD活力。细胞中SOD活力的定义为每毫克组织蛋白在1 mL反应液中抑止率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位（U/mL）。

1.11 双荧光素酶报告基因 使用生物学预测网站microRNA.org进行miR-31的靶基因分析，预测miR-31可能的靶基因，并获取含有作用位点的片段序列。克隆扩增PKD1基因的3'UTR区的全长至pmiRGLO（E1330，Promega，USA）Luciferase载体上，命名为pPKD1-Wt。利用生物信息软件预测miR-31与靶基因PKD1的结合位点，定点突变。构建pPKD1-Mut载体，内参为表达海肾荧光素酶的pRL-TK载体（E2241，Promega，USA），miR-31 mimic以及miR-31 NC分别与pPKD1-Wt和pPKD1-Mut载体共转染，进入HEK-293T细胞（CRL-1415，ATCC，USA），用荧光检测仪（Glomax20/20，Promega，USA）检测荧光强度。

1.12 qRT-PCR检测OGD共培养体系中miR-31和PKD1的表达 6孔板培养的各实验组细胞，采用Trizol（15596026，Invitrogen，USA）一步法提取细胞总RNA，用miRVanaTMmiRNA提取试剂盒（AM1552，Ambion，USA）提取miRNA，紫外分光光度仪（DU640，Beckman，USA）检测RNA纯度和浓度，A260/A280比值在1.8～2.0认为纯度较高。按照PrimeScript RT reagent Kit（RR047A，Takara，Japan）说明书将RNA反转录成cDNA。反应条件为：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；体系20 μL。使用SYBR Premix EX Taq试剂盒（RR420A，Takara）在实时荧光定量PCR仪（ABI 7500，ABI，USA）进行PCR反应，反应体系：SYBR Mix 9 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 8 μL。反应条件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，连续进行40 个循环。每个孔均设置3个重复。U6、miR-31、PKD1和β-actin引物购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司（表1）。记录各孔Ct值，以U6为miR-31内参，β-actin为PKD1内参，采用2－ΔCt法计算产物相对表达量。

表1 引物序列

1.13 Western blot检测OGD共培养体系中PKD1及JAK-STAT3通路相关蛋白表达 6孔板培养的各实验组细胞，分别加入RIPA蛋白裂解液（PS0013，雷根生物技术有限公司，北京），在冰上裂解30 min，以12 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液分装备用。按BCA试剂盒（23250，赛默飞世尔科技有限公司，上海）说明书操作步骤说明测定总蛋白的含量后分装，置入－80 ℃冰箱冷冻待用。各取50 µg各组蛋白，加入蛋白质变性剂（38249090，西巴斯生物公司，上海），煮沸10 min变性，后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）分离，在电泳结束后，用电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜在含有10%脱脂奶粉的PBST中4 ℃封闭后过夜，PBST漂洗（5 min×3 次），分别加入一抗Bax（1:100，ab77566，Abcam，UK）、cleaved caspase-3（1:100，ab49822，Abcam，UK）、PKD1抗体（1:1 000，ab51246，Abcam）、STAT3（1:2 000，ab68153，Abcam，UK）、p-STAT3（1:500，ab30647，Abcam，UK）和GAPDH（1:100，ab9485，Abcam，UK）37 ℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3 次），后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1:1 000，DF109489，瑶韵生物科技有限公司，上海），37 ℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次）后，利用化学荧光法（ECL试剂盒，36208ES60，Amersham Life Sciences公司产品，美国）显色，利用ImageJ灰度分析软件对Western blot检测结果做定量分析。以GAPDH作内参，以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达水平。每份样品均设3个重复。

1.14 统计学分析 所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件进行处理，计量资料采用（±s）标准差的形式表示，多组间的比较应采用单因素方差分析，数据正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov法，呈正态分布的数据多组间比较使用One Way ANOVA中的Tukey's post hoc test，对于偏态分布的数据采用Kruskal-Wallis test中的 Dunn's post hoc test。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控炎症反应 为研究星状胶质细胞内miR-31调控的炎症反应对正常神经元的氧化应激损伤，我们在星状胶质细胞分别转入miR-31 mimic和miR-31 inhibitor，培养24 h后收集培养液，检测其中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量，此外将收集的培养基按照1:5的浓度加入正常神经元培养板各孔之中，其后补加无血清的培养液至每孔液体总量为100 μL，培养48 h后，检测神经元的氧化应激损伤程度。结果显示：与blank和NC组相比，miR-31 mimic组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著降低（均P＜0.05），miR-31 inhibitor组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著上升（均P＜0.05）。与blank和NC组相比，miR-31 mimic组神经元存活率上升，LDH漏出率、ROS表达量显著降低（均P＜0.05），miR-31 inhibitor组神经元存活率显著降低，LDH漏出率和ROS表达量显著升高（均P＜0.05）（图1）。

图1 OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控炎症反应对神经元氧化应激损伤

2.2 OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控对神经元的活性的影响 为研究星状胶质细胞分泌的炎症因子是否会对OGD中神经元的损伤有影响，我们采用神经元和星状胶质细胞进行共培养建立OGD模型，对神经元损伤情况进行检测。结果显示：与单独培养（Neuron组）相比，共培养条件下神经元（Neuron＋astrocytes）的增殖及存活率、LDH表达及凋亡率差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与神经元组（Neuron组）相比，神经元OGD模型组（Neuron OGD组）细胞增殖及存活率减少，培养液中LDH表达增加，细胞凋亡率增加（均P＜0.05）；与神经元OGD模型（Neuron OGD组）相比，神经元＋星状胶质细胞OGD组（Neuron＋astrocytes OGD）细胞存活率减少，培养液中LDH表达增加，细胞凋亡率增加（均P＜0.05）。以上说明共培养体系对神经元和星状胶质细胞的生存活力无显著影响，但OGD模型下，神经元会发生氧化应激损伤，而星状胶质细胞的炎症反应会加重OGD对神经元的氧化应激损伤程度（图2，见封二）。

2.3 双荧光素酶报告基因 通过在线预测软件分析，miR-31与PKD1-3'UTR存在结合位点，PKD1是miR-31的靶基因，图3A双荧光素酶实验结果显示：与NC组相比，野生型miR-31 mimic组的荧光素酶活性强度明显下降（P＜0.05），而突变型质粒荧光素酶活性强度无明显变化（P＞0.05）。说明miR-31能特异结合PKD1-3'-UTR并下调PKD1基因表达（图3B）。

图3 双荧光素酶报告基因

2.4 OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1对各组细胞中mRNA、蛋白表达水平及炎症因子表达量的影响 在OGD建模后共培养体系中，采用qRT-PCR检测星形胶质细胞中PKD1 mRNA（图4A），WB检测PKD1表达和JAK-STAT3通路STAT3蛋白及其磷酸化水平（图4B、C），ELISA试剂盒检测炎症因子表达量（图4D）。结果显示：相比于normal组，blank OGD组的星状胶质细胞中miR-31的表达量下降（P＜0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升（P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调（P＜0.05）；相比于blank OGD组，miR-31 mimic OGD组星状胶质细胞中miR-31的表达量上调（P＜0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低（P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调（P＜0.05）；miR-31 inhibitor OGD组miR-31的表达量下降（P＜0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升（均P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调（P＜0.05）；si-PKD1 OGD组和si-PKD1＋CdCl2OGD组miR-31的表达量无显著变化（P＞0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低（均P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调（P＜0.05）； NC OGD组各指标差异无统计学意义（均P＞0.05）。以上结果说明，星形胶质细胞中miR-31靶向抑制PKD1表达，阻碍JAK-STAT3通路的激活，降低炎症反应。

图4 星状胶质细胞miR-31调控PKD1基因抑制OGD引起的炎症反应

2.5 OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1基因抑制OGD导致的神经元氧化应激损伤 为深入研究星状胶质细胞内miR-31调控PKD1基因介导JAK-STAT3信号通路参与缺血性脑卒中神经元氧化应激损伤保护机制，我们加入miR-31 mimic或inhibitor，si-PKD1或JAK-STAT3通路抑制剂，更有针对性研究各分子具体调控作用。本研究采用MTT、LDH、TUNEL染色和WB检测神经元损伤与凋亡情况。结果显示：相比于normal组，blank组LDH和MDA表达量上升，SOD表达下降，神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强，神经元存活率降低，神经元出现氧化应激损伤（均P＜0.05）；与blank OGD组相比，miR-31 inhibitor OGD组LDH漏出量和MDA表达量上升，SOD表达下降，神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强，神经元存活率降低，细胞凋亡率上升，神经元氧化应激损伤加重 （均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1＋CdCl2OGD组LDH漏出量和MDA表达量下降，SOD表达上升，神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度降低，神经元存活率增加，细胞凋亡率下降，神经元氧化应激损伤减缓（均P＜0.05）；NC OGD组各指标差异无统计学意义（均P＞0.05）。以上结果说明星状胶质细胞miR-31过表达、PKD1沉默和JAK-STAT3通路抑制剂会增加神经元存活率，降低凋亡率，减缓OGD导致的神经元氧化应激损伤（图5A-E，见封二）。

采用TUNEL染色（图5F，见封二）和WB（图5G、H，见封二）检测神经元凋亡情况，结果显示：相比于normal组，blank OGD组神经元细胞凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达显著增加（均P＜0.05）；与blank OGD组相比，miR-31 inhibitor OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显上升（均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1＋CdCl2OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显下调（均P＜0.05）；NC OGD组各cleaved caspase-3、Bax表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。说明OGD模型的建立会导致神经元凋亡加重，而与神经元共培养的星状胶质细胞中miR-31过表达、PKD1沉默和JAK-STAT3通路抑制剂会减缓OGD导致的神经元凋亡程度。

3 讨论

炎症反应和氧化应激都被认为是IS进展的重要致病因素，最终导致神经细胞损伤和细胞死亡。最近的研究表明，在IS的发病机制中miRNA可以作为关键介质，通过沉默转录后基因来影响局灶性脑损伤[6]。此外，各种表达的miRNA可诱导多种信号转导途径，例如，miR-31可调节STAT3的激活[7]。miR-31被认为是一种有效的调节物，对淋巴血管谱系特异性分化和血管发育具有一定的治疗作用，并与氧化应激有关。据报道，氧化应激是脑缺血的一个关键有害因素，通过各种途径导致缺血组织坏死和凋亡。作为DNA氧化应激损伤标记物，4-HNE和8-OHdG在培养的神经元细胞中积累，并有可能导致缺血和OGD。抑制4-HNE和8-OHdG在降低大鼠脑缺血/再灌注损伤后氧化应激相关细胞凋亡方面发挥了重要作用。Caspase-3和Bax的激活与脑缺血大鼠的神经元凋亡有关。mi-31的上调参与炎症反应，并抑制内皮细胞中促炎介质（如IL-6和TNF-α）的下游产生[8]。miR-31的过度表达有能力影响星形胶质细胞，同时也支持成年胶质祖细胞中的胶质细胞存活[9]。基于这些事实，本研究旨在探讨OGD模型乳小鼠的星状胶质细胞miR-31调控PKD1基因表达，抑制JAK-STAT3信号通路活化介导共培养神经元炎症反应以及氧化应激损伤。也有报道称，通过下调多种靶基因和调节下游通路，miRNA有可能影响恶性肿瘤细胞生存[10]。PKD1调节许多生理功能，包括蛋白质转运、免疫系统、血管生成和癌症；它对特定神经疾病的预后和进展起着重要作用。以往的研究表明，降低大脑中的PKD1可减少缺血性神经元损伤[11]。此外，PKD1在体外和体内的直肠阴道念珠菌介导的促炎反应中起着重要作用。我们的研究也表明，过表达miR-31或PKD1基因敲除通过激活JAK/STAT3通路抑制炎症反应和氧化应激诱导的神经元损伤。据报道，miR-31的过度表达抑制了STAT3通路的激活，并通过靶向Wnt影响肠干细胞（ISCS）的辐射损伤[12]。更重要的是，JAK/STAT通路的抑制可降低MMP3的水平，从而调节炎症反应，改善急性IS患者的血脑屏障完整性[13]。

我们的研究结果表明，OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控炎症反应结果显示：与blank和NC组相比，miR-31 mimic组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著降低 （均P＜0.05），miR-31 inhibitor组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著上升（均P＜0.05）；与blank和NC组相比，miR-31 mimic组神经元存活率上升，LDH漏出率、ROS表达量显著降低（均P＜0.05），miR-31 inhibitor组神经元存活率显著降低，LDH漏出率和ROS表达量显著升高（均P＜0.05），说明OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控炎症反应。OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控对神经元的活性的影响结果显示：与单独培养（Neuron组）相比，共培养条件下神经元（Neuron＋astrocytes）的增殖及存活率、LDH表达及凋亡率差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与神经元组（Neuron组）相比，神经元OGD模型组（Neuron OGD组）细胞增殖及存活率减少，培养液中LDH表达增加，细胞凋亡率增加（均P＜0.05）；与神经元OGD模型（Neuron OGD组）相比，神经元＋星状胶质细胞OGD组（Neuron＋astrocytes OGD）细胞存活率减少，培养液中LDH表达增加，细胞凋亡率增加（均P＜0.05），以上说明共培养体系对神经元和星状胶质细胞的生存活力无显著影响，但OGD模型下，神经元会发生氧化应激损伤，而星状胶质细胞的炎症反应会加重OGD对神经元的氧化应激损伤程度。OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1对各组细胞中mRNA、蛋白表达水平及炎症因子表达结果显示：相比于normal组，blank OGD组的星状胶质细胞中miR-31的表达量下降（P＜0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升（P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调（P＜0.05）；相比于blank OGD组，miR-31 mimic OGD组星状胶质细胞中miR-31的表达量上调（P＜0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低（P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调（P＜0.05）；miR-31 inhibitor OGD组miR-31的表达量下降（P＜0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升（均P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调（P＜0.05）；si-PKD1 OGD组和si-PKD1＋CdCl2OGD组miR-31的表达量无显著变化（P＞0.05），而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低（均P＜0.05），炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调（P＜0.05）；NC OGD组各指标差异均无统计学意义（均P＞0.05）；OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1基因抑制OGD导致的神经元氧化应激损伤结果显示：相比于normal组，blank OGD组LDH和MDA表达量上升，SOD表达下降，神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强，神经元存活率降低，神经元出现氧化应激损伤（均P＜0.05）；与blank OGD组相比，miR-31 inhibitor OGD组LDH漏出量和MDA表达量上升，SOD表达下降，神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强，神经元存活率降低，细胞凋亡率上升，神经元氧化应激损伤加重（均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1＋CdCl2OGD组LDH漏出量和MDA表达量下降，SOD表达上升，神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度降低，神经元存活率增加，细胞凋亡率下降，神经元氧化应激损伤减缓（均P＜0.05）；NC OGD组各指标差异无统计学意义（均P＞0.05）；采用TUNEL染色及Western blot检测OGD共培养体系中神经元凋亡结果显示：相比于normal组，blank OGD组神经元细胞凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达显著增加（均P＜0.05）；与blank OGD组相比，miR-31 inhibitor OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显上升（均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1＋CdCl2OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显下调（均P＜0.05）；NC OGD组各cleaved caspase-3、Bax表达差异无统计学意义（均P＞0.05），以上结果说明，OGD模型乳小鼠星形胶质细胞中miR-31靶向抑制PKD1表达，阻碍JAK-STAT3通路的激活，降低炎症反应。

总之，以上结论表明miR-31的过度表达通过下调PKD1激活JAK/STAT3通路，从而抑制OGD神经元炎症反应和氧化应激诱导损伤。我们的发现可能阐明了通过干预miR-31的表达靶向调控PKD1激活JAK/STAT3通路，以对IS的神经保护机制提供理论依据。