徐文杰 韩士群 周庆 巫佳杰 陈婷

摘要：通过40 d的体表暴露试验，研究了饲料中添加α-硫辛酸、抗坏血酸（VC）对鲫鱼暴露于铜绿微囊藻污染水体的保护作用。试验期间水体中微囊藻毒素-LR（MC-LR）质量浓度维持在19.40 μg/L左右，试验组饲料中α-硫辛酸和VC的添加量均为600 mg/kg，测定鲫鱼生长性能、MC-LR解毒效果和肝脏抗氧化能力。结果表明，与负对照组相比，饲料中添加α-硫辛酸组和VC组鲫鱼增质量率显著提高（P<0.05），分别提高了4.91%和3.21%;鲫鱼肌肉中MC-LR含量显著降低（P<0.05），分别降低了40.72%、14.20%;肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、总抗氧化能力（T-AOC）显著提高（P<0.05），分别提高了79.35%和72.53% 、79.35%和72.53%、34.93%和24.43%;肝脏丙二醛（MDA）含量显著降低（P<0.05），分别降低了57.26%和48.86%。可见，饲料中添加α-硫辛酸、VC能够显著提高鱼体的抗氧化能力，减轻MC-LR对鱼体的氧化损伤，进而减少MC-LR在鱼体内的积累，减轻MC-LR对鲫鱼的毒害作用。

关键词：α-硫辛酸;抗坏血酸;微囊藻毒素;鲫鱼;抗氧化能力

中图分类号：S963.73文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0417-06

Abstract：In this study， the effects of dietary α-lipoic acid and ascorbic acid （VC） on microcystin-induced toxicosis in crucian were investigated by 40-days exposure test. During the test， the mass concentration of microcystin-LR （MC-LR） in water was maintained at about 19.40 μg/L. The additions of α-lipoic acid and VC in the experimental group were 600 mg/kg， and the growth performance， MC-LR detoxification and liver antioxidant capacity of the crucian were investigated. Compared with the negative control group， the weight gain rate increased by 4.91% and 3.21% in crucian fed with α-lipoic acid and ascorbic acid （P<0.05）， meanwhile， the MC-LR content in the muscle decreased by 40.72% and 14.20% （P<0.05）， respectively. Furthermore， activity of glutathione peroxidase （GSH-Px） increased by 79.35% and 72.53% （P<0.05）， the activity of superoxide dismutase （SOD） increased by 79.35% and 72.53% （P<0.05）， and the total antioxidant capacity （T-AOC） increased by 34.93% and 24.43% （P<0.05）， malondialdehyde （MDA） content decreased by 57.26% and 48.86% （P<0.05） in crucian fed with α-lipoic acid and VC. In conclusion， dietary α-lipoic acid and VC can effectively improve the antioxidant capacity of crucian， reduce the oxidative damage and the accumulation of MC-LR.

Key words：α-lipoic acid;ascorbic acid;microcystin;crucian;antioxidant capacity

中國是世界渔业大国，淡水养殖面积和产量位列世界第一。自20世纪90年代以来水产养殖业发展迅速并呈现高密度、集约化、规模化的特点，形成了高生物负载量和高投入量的养殖模式，大量鱼类的排泄物和残留饵料在水体中分解产生大量的氮、磷营养元素，使得水体富营养化日益严重，水华频频暴发[1-3]。水华藻类可合成多种有毒物质，最典型的是一类具有生物活性的环状七肽，即微囊藻毒素（Microcystins， MC），微囊藻、项圈藻、念珠藻和颤藻等均可产生微囊藻毒素[4]。微囊藻毒素有200多种结构类似物，其中微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR， MC-LR）是最为常见且毒性最强的一种，其次为微囊藻毒素-RR（Microcystin-RR， MC-RR）和微囊藻毒素-YR（Microcystin-YR， MC-YR）。以往的研究结果表明MC可以积聚在蜗牛、虾以及淡水湖泊中鱼类等水生生物的组织中[5-7]。MC能影响鱼类生长速度，导致鱼类腮、肝、肾、肠道、心脏等脏器发生病理学改变，影响鱼类行为并能诱发鱼体内相关解毒酶活性的改变[8-9]。受MC污染的鱼类可通过食物链对人体健康构成威胁。因此，有必要开展增强鱼体对抗微囊藻毒素毒害作用的研究。

有研究者指出，污染物胁迫下生物体活性氧的产生及导致的氧化损伤是污染物致毒的重要途径，MC可以诱导细胞内产生活性氧，导致细胞损伤和脂质过氧化，MC的肝脏毒性部分也是由于诱导活性氧的产生所致[10-11]。α-硫辛酸不仅能够清除氧自由基、螯合重金属离子，还具有修复氧化损伤的作用[12]。VC可以为超氧化物自由基和羟基等提供電子来终止自由基活性，从而减轻自由基对机体氧化损伤[13]。目前，关于MC对鱼类的毒理以及抗氧化剂对鱼解毒的研究中采用的暴露途径主要为腹腔注射或灌喂，而对低浓度长期体表暴露的毒害作用及抗氧化剂的解毒作用研究比较少，体表暴露能更好地模拟真实水华水体中MC对鱼体的影响，目前有关VC在缓解微囊藻毒素对鱼体毒害作用的研究尚无报道。本研究采用将鲫鱼暴露于铜绿微囊藻污染水体中的方式，研究饲料中添加α-硫辛酸、VC对鲫鱼生长、毒素在体内的积累以及肝脏抗氧化能力的影响。

1材料与方法

1.1试验材料

产微囊藻毒素铜绿微囊藻（FACHB-912）购于中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库，采用BG11 培养基进行扩大培养。试验饲料原料为成品饲料，饲料原料经过40目筛粉碎，在基础饲料中分别添加α-硫辛酸、VC使其质量比均为600 mg/kg，混合均匀后用挤压机制成颗粒直径为2.0 mm 的饲料，45 ℃烘干冷却后放入密封袋中于-15 ℃冰箱中保存待用。试验鱼为鲫鱼，运回实验室后用高锰酸钾溶液浸泡消毒10～15 min，暂养驯化14 d后，挑选体质健康、大小基本一致的试验鱼（平均质量460 g）用于后续试验。

1.2试验方法

试验鱼随机分为4组（生长在无毒环境中投喂基础饲料的正对照组、生长在铜绿微囊藻污染水体中投喂基础饲料的负对照组、投喂含α-硫辛酸饲料的试验组1、投喂含抗坏血酸饲料的试验组2），每组设3个重复，每个重复20尾鱼，随机放入周转箱中进行饲养试验，试验期40 d。暴露期间，向水体中加入培养至对数生长期的铜绿微囊藻培养液，每隔2 d换一半水，并补充铜绿微囊藻培养液至预设值。定期采水样检测水体中MC-LR质量浓度，试验期间MC-LR质量浓度基本维持在19.40 μg/L左右，可认为暴露期内受试鲫鱼始终接触一个恒定的MC-LR暴露质量浓度。每天投饲2次（9∶00和16∶00），饲料投喂量为鱼体质量的4%，根据鱼体增长情况，在投喂率一定的基础上定期调整投喂量。试验期间水温约25 ℃，pH 7.5，氨态氮<0.02 mg/L。

试验期间，每隔5 d取水样测定水体中MC-LR质量浓度;每隔10 d从各周转箱分别随机取2尾鱼，称质量后在冰盘上解剖，取背部白肌于-20 ℃冰箱保存，测定肌肉中MC含量。试验结束后，另取6尾鱼于冰盘上解剖，取肝脏，-20 ℃保存，用于测定肝组织蛋白质含量、甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量。

1.3测定方法

水体中MC-LR含量的测定：取水样，过0.45 μm的滤膜，取适当体积的滤液注入SPE固相萃取装置中，使滤液流经预活化的C18固相萃取小柱进行富集、淋洗及洗脱。洗脱液经旋转蒸发后用20%的甲醇定容，用于高效液相色谱（HPLC）分析。色谱条件参照GB/T 20466-2006[14]的方法。

鱼肌肉MC-LR含量的测定：取背部白肌，样品经冷冻干燥后碾磨成粉末。肌肉样品MC-LR的提取参照GB5009.273-2016[15]进行，肌肉组织中MC-LR含量的测定采用HPLC方法。

肝脏抗氧化能力指标测定：取肝脏组织块（0.1～0.2 g）在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称质量，放入5 ml的匀浆管中。按重量（g）∶体积（ml）=1∶9的比例加入9倍体积的0.86%的生理盐水于匀浆管中，冰水浴条件下，剪碎组织块，于内切式组织匀浆机中制备成10%的组织匀浆备用。肝组织匀浆蛋白质含量、T-AOC、SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量的测定均采用相应的试剂盒，试剂盒购于南京建成生物工程研究所，具体操作流程按照说明书要求进行。

1.4数据分析

采用SPSS 24软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较处理间差异性。

2结果

2.1饲料中添加抗氧化剂对鲫鱼增质量率和存活率的影响

经过40 d试验，饲料中添加α-硫辛酸、VC对鲫鱼生长及存活的影响如表1所示。从表1中可以看出，各组的存活率均为100%，表明MC-LR暴露质量浓度为19.40 μg/L时不能直接导致鲫鱼死亡。试验初期，各组鱼平均质量无显著差异，经过40 d的试验，负对照组、α-硫辛酸组和VC组鱼体平均质量[分别为（492.78±9.62） g、（516.33±10.33） g、（504.72±6.15） g]和增质量率（分别为6.25%±0.27%、11.16%±0.49%、9.46%±0.20%）均低于正对照组[（529.22±7.91） g、14.37%±0.58%]。说明铜绿微囊藻所释放的MC-LR对鱼体有毒害作用，可抑制鱼类的生长。在饲料中添加α-硫辛酸和VC能够在一定程度上缓解MC-LR对鱼体的毒害作用，与负对照组相比，增质量率显著提高（P<0.05），分别提高了4.91%和3.21%。结果说明在饲料中添加一定量的α-硫辛酸和VC能够缓解MC-LR对鲫鱼生长的抑制作用。

2.2饲料中添加抗氧化剂对鲫鱼肌肉中微囊藻毒素含量的影响

图1为暴露于MC-LR的各组鲫鱼肌肉组织中微囊藻毒素含量变化。正对照组鲫鱼肌肉组织中未检出MC-LR。由图1可知，经过40 d的暴露，MC-LR在鲫鱼体内出现了不同程度的积累。40 d后，负对照组、α-硫辛酸组和VC组鲫鱼肌肉中MC-LR含量分别为（81.58±2.78） ng/g、（48.36±1.77） ng/g、（69.99±2.41） ng/g。在饲料中添加α-硫辛酸和VC能显著降低鱼肌肉中MC-LR的含量（P<0.05），与负对照组相比分别降低了40.72%、14.20%，其中α-硫辛酸的效果优于VC。

2.3饲料中添加α-硫辛酸、VC对鲫鱼抗氧化能力的影响

由图2可知，经过40 d的暴露试验，各处理组和负对照组鱼体肝脏中GSH-Px活性均显著低于正对照组（P<0.05）。与负对照组相比，饲料中添加α-硫辛酸和VC后，鲫鱼肝脏GSH-Px活性均显著升高（P<0.05），分别提高了79.35%和72.53%，α-硫辛酸組和VC组之间无显著差异（P=0.064）。负对照组肝脏SOD活性显著低于正对照组（P<0.05），α-硫辛酸组和VC组肝脏SOD活性与负对照组相比显著提高（P<0.05），分别提高了79.35%和72.53%。各处理组和负对照组鱼体肝脏中T-AOC均显著低于正对照组（P<0.05）。与负对照组相比，饲料中添加α-硫辛酸和VC后，鲫鱼肝脏T-AOC 均显著升高（P<0.05），分别提高了34.93%和24.43%，α-硫辛酸组的总抗氧化能力与VC组无显著差异。处理组和负对照组肝脏MDA含量均显著高于正对照组（P<0.05），α-硫辛酸组、VC组肝脏MDA含量显著低于负对照组（P<0.05），分别比负对照组减少了57.26%和48.86%。

3讨论

生长性能是评价鱼类健康的一个重要指标，通常以增质量率来表示。本研究中，负对照组鲫鱼增质量率显著低于正对照组，说明长期暴露于铜绿微囊藻水体中鲫鱼生长受到显著抑制。类似的抑制作用在其他研究中也有报道。Dong 等[16]发现用含蓝藻的饲料饲喂鲤鱼幼鱼和杂交鲟后，鱼的生长速率显著下降。暴露于30 μg/g MC-LR 10 d后，鳙鱼幼鱼的生长受到明显抑制[17]。以往的研究结果表明，饲料中添加抗氧化剂硫辛酸能显著提高奥尼罗非鱼生长性能和饲料利用率[18];在饲料中添加适量的VC对石斑鱼、泥鳅幼鱼生长有明显的促进作用[19]。本研究发现，与负对照组相比，在饲料中添加一定量α-硫辛酸和VC能够显著提高鲫鱼的平均质量和增质量率，说明α-硫辛酸和VC能够缓解MC-LR对鱼体的毒害作用。

有关微囊藻毒素在鱼体内的累积有许多研究报道。Xie等[20]在巢湖鲤鱼的肌肉、肝脏和肠道中均检出微囊藻毒素，其在肌肉中的含量达到0.66 μg/g。姜锦林[21]研究指出，暴露于低浓度MC-LR的鲤鱼肝脏和肌肉中均积累了一定的MC-LR。本研究中，暴露于MC-LR水体中的鲫鱼肌肉中出现MC-LR累积，与其他研究结果相吻合。试验期间，α-硫辛酸组和VC组鲫鱼肌肉中微囊藻毒素含量显著低于负对照，说明在饲料中添加α-硫辛酸和VC能够显著降低MC-LR在鲫鱼体内的积累。董桂芳等[22]研究发现饲料中添加谷胱甘肽（Glutataione， GSH）能显著降低黄颡鱼肌肉和肝脏的MC含量，引起这一现象的原因可能是GSH被鱼组织吸收后与微囊藻毒素结合，更利于GSH和MC结合物的代谢和排出体外。张丽等[23]的研究结果表明，添加α-硫辛酸可降低罗非鱼体肝脏和肌肉中MC含量，α-硫辛酸能有效阻止GSH在解毒过程中被活性氧（Reactive oxygen species， ROS）氧化为GSSG，并能持续提高GSH还原酶的活性，加速解毒过程的完成。

GSH-Px、SOD是动物体内重要的抗氧化酶，在机体抗氧化应激中起重要作用。GSH-Px可以使有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物干扰及损害[24]。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O2·-），保护细胞免受损伤[25-27]。SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。MC可以通过多种途径破坏体内自由基的平衡和抗氧化系统的功能，导致机体氧化损伤。这些自由基及其产物在细胞中最具破坏性的作用之一是膜脂的过氧化，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映生物机体受到自由基攻击的程度，是细胞氧化损伤的敏感诊断指标[28-30]。总抗氧化能力（T-AOC）用于衡量生物体抵抗外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态，包括机体抗氧化酶系统和非酶促系统[31]。MC暴露的主要毒性作用是氧化应激。Zhang等[32]报道在12 h试验中注射3次150 g/kg MC-LR的鲫鱼肝脏MDA含量显着增加。许多研究结果表明使用不同类型的抗氧化剂，可以有效地提高生物的抗氧化能力，进而起到降低污染物毒性的作用。Amado等[33]的研究结果表明，α-硫辛酸可以通过增加鲤鱼肝脏和大脑中谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性或通过修复GST抑制刺激解毒，降低MC诱导的毒性。类延菊等[34]的研究结果表明，饲料中添加硫辛酸显著提高了铜胁迫下皱纹盘鲍的肝胰脏SOD、GSH-Px活性及GSH含量，显著降低铜的沉积量，并在一定程度上减轻肝胰脏蛋白质、DNA损伤以及脂质过氧化。朱选等[35]指出，饲料中添加GSH能够促进草鱼肝脏和肌肉中GSH的沉积，提高肝脏中GSH-Px和SOD活性与总抗氧化能力，减少肝脏中MDA含量，降低肝脏及血清中ROS含量。彭士明等[36]的研究结果表明，增加VC质量分数可显著提高银鲳组织中SOD活性及总抗氧化能力。本试验中，处理组和负对照组鱼体肝脏中GSH-Px活性、SOD活性、总抗氧化能力均显著低于正对照组，MDA含量均显著高于正对照组，说明鲫鱼暴露在MC-LR水体中会造成鱼体的氧化机能损伤;在饲料中添加α-硫辛酸、VC后鲫鱼肝脏GSH-Px、SOD活性及T-AOC均显著高于负对照组，MDA含量均显著低于负对照组，表明饲料中添加α-硫辛酸、VC能够有效提高鱼体的抗氧化能力，进而减少MC-LR在鱼体内的积累，减轻MC-LR对鲫鱼的毒害作用。

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（责任编辑：张震林）