吴 群 石梦琪 刘慜妮 张 琰 鄂玲玲 刘洪臣

高性能战机在飞行中所产生的正加速度常用G值表示，具有G 值高、增长快、持续时间长的特点。当G 值超过飞行员的生理耐受限度时，会对飞行员的身心造成影响，成为影响飞行安全的重要因素[1]。飞行过程中，高正加速度对机体各个系统均产生不同程度的影响，目前多数研究表明，高正加速度对机体心血管、意识、骨骼等系统均有影响，例如，在高正加速度状态下可引起舌横纹肌细胞间质稀疏、部分排列紊乱等损伤[2,3]。但飞行过程中对嚼肌损伤及防护的报道比较少。本实验以高+Gz值暴露下的大鼠模型为研究对象，通过组织学观察、检测bcl-2、bax、Caspase-3、细胞色素C的表达，探讨高正加速度对嚼肌肌细胞的影响以及黄芪(astragalusmembranaceus,AM)的防护作用，以寻求一种防护方法及探讨其作用机制。

1.材料与方法

1.1 材料 选健康雄性SD 大鼠，SPF 级，5 周龄，体重在180g-220g(解放军总医院实验动物研究中心)许可证号SCXK(京)2012-0001；模拟加速度动物离心机(空军507 航空研究所)；动物实验的手术器械、生理盐水(0.9%Nacl，250ml/瓶，安徽双鹤药业责任有限公司)国药准字：H34023608)；AM 注射液(正大青春宝药业有限公司，国药准字Z33020179，10ml/支，2g/ml)。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 30 只SD 大鼠(雄性，200g)适应性喂养一周后，称重，随机分5 组。分别为：对照组，+10Gz 组，+10Gz+低剂量黄芪组(+10Gz+LAM)，+10Gz+中剂量黄芪组(+10Gz+MAM)，+10G+高剂量黄芪组(+10Gz+HAM)，每组6 只，分笼饲养并做标记。各组动物每天上午腹腔注射给药一次，连续14 天，给药剂量为10ml/kg，低浓度组，中浓度组，高浓度组的AM 浓度分别为0.5g/ml，1g/ml，2g/ml，对照组、+10Gz 组给予等量的生理盐水注射。除对照组外，其余4 组均在完成14 天腹腔注射处理后次日接受+10Gz 正加速度处理。

1.2.2 模拟高正加速度大鼠模型制备 +Gz 暴露方式：采用离心机模拟+Gz 暴露，利用特制固定装置承载大鼠，固定于动物离心机转臂上，大鼠头朝向离心机，离心半径1.9m，每只大鼠专用一个固定盒。实验前大鼠禁食12h，实验组大鼠暴露于+10Gz 条件下，持续5min，加速度增长率1G/s，由计算机控制；对照组不做任何处理。大鼠经高G值暴露4 小时后颈椎脱臼法处死，立即交替取双侧嚼肌分别供组织学观察、RT-PCR 及Western blot检测。

1.2.3 组织学观察 将嚼肌组织标本置于4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M,pH=7.4)中固定24h 后进行常规石蜡包埋,切片,切片厚度5μm。再按实验室常规进行脱蜡、染色、封片。

1.2.4 RT-PCR 法检测bcl-2、Bax 的表达取冻存的组织样品研磨，以每1mlTrizol 液0.2ml的比例加入氯仿进行抽提，用异丙醇沉淀，回收总RNA，溶于DEPC 水中。取5μg RNA 进行逆转录。逆转录条件为：50℃、50min，85℃、5min，立即放置到冰上。引物序列分别为：Bax-F：CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，Bax-R：CCAGCCCATGATGGTTCTGAT，bcl-2-F:GGTGGGGTCATGTGTGTGG，bcl2-R:CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC，内参GAPDH-F：AC AACTTTGGTATCGTGGAAGG，GAPDH-R:GCCATCACGCCACAGTTTC。PCR 反应条件为：95℃,2 min 0 secs，95℃,hold 10 secs，60℃,hold 30 secs。循环扩增结束后，取10μL 反应产物进行2%的琼脂凝胶电泳，应用ABI7900(SDS2.3 软件)进行分析。

1.2.5 Western-blot 法检测Caspase-3 和细胞色素C 的表达 取各组嚼肌组织50～100mg，取总蛋白，测定蛋白浓度，进行定量，取各个组蛋白提取液，调整蛋白浓度，3000 转/min 离心1min。每孔加样液20μg，恒压电泳，约30min，转膜结束后，快速取出PVDF 膜，放入5%BSA室温封闭2h。取出膜，于摇床上用TBST 洗膜5min×3 次。孵育袋中加入封闭液稀释的cytochromeC(博士德1∶200)、caspase-3(abcam 1∶200)和GAPDH (weiao 1∶2000)，4℃孵育过夜。TBST 洗膜5min×3 次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Jackson 1∶2000)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(Jackson 1：2000)室温孵育2h。TBST 洗膜15min×5 次。膜于化学发光检测试剂(试剂A∶试剂B＝1∶1)反应2min，取出膜，感光、显影、定影。

1.3 统计学处理 采用Graph Pad Prism 6.0统计软件对数据进行方差分析，数据用mean±SD表示，组间两两比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 嚼肌组织学改变 大鼠嚼肌组织学改变见图1。正常组大鼠嚼肌肌纤维排列整齐，粗细均匀，肌肉横纹清晰；+10Gz 组的嚼肌纵切面见肌血管扩张，组织充血，部分肌纤维扭曲、横纹消失，出现肌肉收缩带，部分甚至出现个别肌纤维坏死溶解，细胞核向中央移位见“核串”，横切面见部分肌纤维横径变小，纤维呈棱角形；AM 低中高各浓度组肌肉组织学改变程度逐渐减轻，高浓度组肌肉组织学改变程度最轻。

图1 各组大鼠嚼肌组织病理特征

2.2 嚼肌细胞Bax,bcl-2 mRNA 表达 嚼肌细胞Bax,Bcl-2 mRNA 表达详见表1 和图2。

表1 不同处理情况下，大鼠咀嚼肌细胞内Bax 和Bcl-2 的表达(平均值±SD,n=6)

图2 咀嚼肌细胞内Bax 和Bcl-2 mRNA 的表达

如表1 和图2 的结果显示，+10Gz 组同正常组相比较，Bax 的表达水平显著升高(P＜0.05)，Bcl-2 的表达水平显著降低(P＜0.05)，AM 注射液中，高浓度组较+10Gz 组Bax 表达水平显著降低(P＜0.01)，Bcl-2 表达水平显著增高(P＜0.01)；但低浓度组与+10Gz 组相比，Bax、Bcl-2 表达水平与+10Gz 组差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 嚼肌细胞Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白表达 嚼肌细胞Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白表达详见图3 和表2。

图3 大鼠咀嚼肌细胞内caspase-3 和Cytochrome C 的蛋白表达

表2 不同处理情况下大鼠咀嚼肌细胞内caspase-3 和Cytochrome C的表达(平均值±SD,n=6)

如图3 和表2 所示，+10Gz 组同正常组相比，caspase-3 和细胞色素C 的表达水平显著升高(P＜0.05)；黄芪注射液各浓度组的caspase-3 和细胞色素C 表达水平较+10Gz 组表达水平均有所降低，除低浓度组细胞色素C 表达水平与+10Gz 组相比差异无统计学意义外，其余差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

3.讨论

G 值是指飞机飞行时产生的由头至脚方向的加速度，高+Gz 是指加速度大于7 G，持续性是指空中战机动或特技飞行时连续两个空中战动作循环，持续6～15s[4]。在高+Gz 下可引起嚼肌损伤，组织变形移位，部分肌纤维扭曲、断裂、横纹消失[5]。因而探索如何减轻高正加速度对嚼肌的损伤是本实验的目的所在。本实验中大体标本嚼肌形态学显示：+10Gz 组嚼肌肌内血管扩张，组织充血，部分肌纤维扭曲、横纹消失，出现肌肉收缩带，少量甚至出现个别肌纤维坏死溶解,细胞核向中央移位见“核串”，+10Gz 组的嚼肌的横切面见部分肌纤维横径变小，纤维呈棱角形。+10Gz 组嚼肌组织学改变明显较AM 各浓度组严重；AM 各浓度组随着AM 浓度增高，嚼肌损伤表现逐渐减轻，+10Gz+HAM 组嚼肌形态改变最小，+10Gz+LAM 组嚼肌形态学改变最大。本实验结果表明，高+Gz 暴露可致嚼肌损伤，高+Gz 暴露前应用AM 注射液具有保护作用，且与剂量相关。

目前中药成为细胞损伤保护的研究点，黄芪(Astragalusmembranaceus,AM)是其中的一种，黄芪注射液是提取AM 的有效成分制成的水溶液，主要成分：AM 皂苷类、黄酮、氨基酸、多糖及微量元素，具有调节机体免疫功能，增强细胞代谢，强心降压，改善血液循环及抗衰老等作用。AM 能有效地对抗脑、肾、肠等脏器缺血再灌注损伤，保护内皮细胞，降低中性粒细胞浸润，减少细胞凋亡[5,6]。鉴于AM 具备的多种功效，本实验探索性的尝试用AM 保护高+Gz 值暴露对咀嚼肌的损伤，组织学观察结果显示，AM 具有一定保护作用，且与剂量有关。

细胞凋亡与凋亡相关基因和蛋白的表达有关[7]。在动物细胞中，线粒体通路是最普遍的凋亡机制和细胞凋亡核心，其功能及作用越来越受到关注[8,9]而这一通路的激活又依赖线粒体膜电位的下降以及线粒体内的细胞色素C 释放到胞质，触发caspase的级联反应，从而诱发细胞凋亡[10]。细胞色素C和Caspase-3 分别作为线粒体凋亡途径的启动和关键执行因子，在细胞凋亡中有着不可替代的地位，也是检测线粒体途径导致细胞凋亡的重要指标[11]。有研究表明[12,13]，Bcl-2 对线粒体外膜通道的稳定起重要作用。各种凋亡刺激信号可通过BH3-only 蛋白引起Bax 蛋白移位到线粒体外膜并多聚化，形成膜通道，从而使线粒体的许多功能发生致命性的改变，使原先位于线粒体内的参与细胞凋亡的相关活性物质释放出来，如细胞色素C(Cytochrome C)等，进而激活Caspase-3 蛋白酶，启动不可逆的细胞凋亡途径。

我们在前期的实验中发现，+10Gz 暴露大鼠咀嚼肌出现TUNEL 染色阳性细胞，且显著增多(P＜0.01)，提示+10Gz 暴露可导致咀嚼肌细胞凋亡[14]。本实验中应用RT-PCR 法及Westernblot 法检测与细胞凋亡相关的Bcl-2mRNA、BaxmRNA及胞浆内的Caspase-3 和细胞色素C 蛋白的表达。结果表明，+10Gz 暴露可致大鼠嚼肌细胞BaxmRNA 表达水平显著升高，Bcl-2mRNA 表达水平显著降低以及caspase-3 和细胞色素C 蛋白表达水平显著升高；预先应用AM 可以抑制上述mRNA 和蛋白的异常表达，并且呈剂量依赖性。Bax 表达增高，有利于线粒体膜上形成通透性孔道，而Bcl-2 表达降低则进一步促进通透性孔道的形成，从而使细胞色素C 释放、Caspase-3 活化，导致细胞凋亡。本实验结果显示+10Gz 暴露可致大鼠嚼肌细胞凋亡相关基因和蛋白表达发生改变，AM 的保护作用可能与抑制细胞凋亡相关基因和蛋白的异常表达有关。

战机高正加速度可致嚼肌损伤、肌细胞凋亡，中药黄芪可能通过抑制细胞凋亡相关基因和蛋白的异常表达，保护嚼肌免受+10Gz 暴露的伤害，且有浓度依赖性，随着浓度的增加，保护作用增强，对飞行员的训练及防护有指导性作用。但黄芪通过何种通路导致嚼肌细胞凋亡降低尚待进一步研究。