鞠薇薇

乳腺癌在女性恶性肿瘤发病率居第一位,且发病率近年来逐年提高,发病群体日益年轻化［1］。原癌基因HER-2 是目前恶性肿瘤研究的重点之一,已有许多文献报道指出20%～30%的乳腺浸润癌中有HER-2 基因的过表达现象［2,3］。HER-2 基因状态对乳腺癌患者的预后、风险评估、内分泌治疗、化疗、生物靶向治疗等均有显著影响。HER-2 基因是乳腺癌的重要分子标志物和治疗靶,准确把握HER-2 基因信息有利于指导临床医师治疗［4］。对此,本研究对比分析两种HER-2 基因检测方法,探索HER-2 基因检测中IHC与FISH 检测的一致性,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院妇产科2016 年1 月～2019 年6 月诊治的50 例新发乳腺癌患者作为研究对象,均为女性,经HE 染色制片确诊为浸润性乳腺癌,未接受术前辅助化学治疗等。年龄36～69 岁,平均年龄(54.3±6.1)岁；其中浸润性导管癌45 例,浸润性小叶癌5 例。

1.2 方法 经手术切除或粗针穿刺活检获取的乳腺癌标本分成2 份,分别采用FISH 技术和IHC 技术进行HER-2 基因检测。具体如下。

1.2.1 FISH 技术 将标本切片使用二甲苯脱蜡至水化,然后在室温下依次采用100%、85%、70%的乙醇梯度脱水,各脱水2 min,然后在去离子水中浸泡30 min,在50℃下浸入30%酸性亚硫酸钠溶液30 min,使用2×SSC 缓冲液洗片2 次后,将切片置入37℃蛋白酶K溶液中浸泡4～10 min,然后再次洗片后置入0.1 mol/L盐酸(HCl)中,室温下浸泡5～10 min。洗片后将切片依次在-20℃的70%、85%、100%乙醇中脱水各2 min,室温下浸入丙酮2 min,然后在空气中自然风干切片,然后56℃烤片5 min,滴加10 μl 探针混合液到切片上,73℃变性5 min 后在原位杂交仪中杂交,42℃湿盒杂交过夜14～18 h,然后分别使用2×SSC、0.3%、NP-40 洗涤液中洗片,洗去多余的探针,然后在室温下暗处干燥,滴加10 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)显色液复染,盖玻片后在荧光显微镜下观察。

1.2.2 IHC 技术 标本切片常规脱蜡至水化,将切片置入枸缘酸钠缓冲液中,微波加热2 次,5 min/次,修复抗原,待切片自然冷却到室温后,使用PBS 缓冲液洗片3 次,滴加工作浓度的一抗,放入预热湿盒中,37℃,60 min,PBS 冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,37℃下孵化30 min,用PBS 洗脱；滴加100 μl 二氨基联苯胺(DAB)显色液,自来水冲洗；苏木素复染,封片,在镜下观察。

1.3 观察指标 观察IHC 与FISH 检测结果、FISH检测17 号染色体多体发生情况。

1.4 结果判读 ①IHC：C-erbB-2 阳性为+++,>30%的肿瘤细胞呈现强而完整的细胞膜着色；可疑为++,阴性为+或0 表达。(2)FISH：计数30 个细胞统计Ratio 值,当Ratio 值<1.8 时为阴性,表示无HER-2 基因扩增；Ratio 值>2.2 时为阳性,存在HER-2 基因扩增；Ratio值在1.8～2.2 之间时可选择计数细胞100 个再次统计Ratio 值。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计算Kappa 值进行一致性检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IHC 与FISH 检测结果 IHC 结果为+++、++、+/0 时,IHC 与FISH 检测结果的阳性符合率分别为87.50%、94.59%、20.00%。在IHC 检测为+++、++的标本中,FISH 检测中有93.33%(42/45)显示为HER-2基因扩增；在IHC 检测为+/0 的标本中,FISH 检测中有20.00%(1/5)显示为HER-2 基因扩增。经一致性检验,IHC 与FISH 检测结果一致性较好(Kappa 值=0.543,P<0.05)。见表1。

表1 IHC、FISH 检测结果(n,%)

2.2 FISH 检测17 号染色体多体发生情况 50 例患者中,经FISH 检测发现,17 号染色体总多体发生率为18.00%(9/50),其中在IHC 检测HER-2 高表达(+++、++)患者中的多体发生率为17.78%(8/45),在HER-2 低表达或无表达(+、0)患者中的多体发生率为20.00%(1/5),比较差异无统计学意义(χ2=0.015,P=0.902>0.05)。

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤,其发病率近年来逐年提高。HER-2 基因是原位基因,又被称为C-erbB 基因,其与乳腺癌的发病、发展、预后密切相关。HER-2 基因的扩增表达检测越来越受到临床重视,称为乳腺癌临床治疗、预后判断的重要辅助手段［5］。目前临床上进行HER-2 基因检测的方法主要是IHC 技术和FISH 技术,IHC 是以组织为基础的蛋白检测方法,HER-2 基因扩增的肿瘤细胞存在明显的膜着色,而含有正常HER-2 基因拷贝数的乳腺癌在不会有特殊的着色反应。IHC 方法操作简单、费用低廉、可重复性好,且对相关材料要求不高；但是由于蛋白在标本固定、处理过程中易变性破坏等,从而影响检测结果；加上抗体的不同批号差异以及结果判断的主观性等,使得IHC 技术在检测中易出现假阴性、假阳性问题,影响临床诊疗［6］。FISH 技术是一门新兴的分子细胞遗传学技术,其被广泛用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析等领域中,其以组织为基础,适用于石蜡包埋的组织块,通过检测基因拷贝数来评估HER-2 基因水平,是HER-2基因检测的金标准［7］。与IHC 技术相比,FISH 技术有如下优势：对低倍、高倍和染色体非整倍性的扩增检测均有较高的准确率,灵敏度、特异度高,结果为双色荧光信号,能避免绿色荧光的干扰,直接准确得到基因扩增的拷贝数,是目前HER-2 基因扩增的金标准。

本次研究结果显示：IHC 与FISH 检测结果一致性较好(Kappa 值=0.543,P<0.05),而IHC 技术具有操作简单、费用低等优势,而FISH 技术检测步骤繁琐、要求高,故而IHC 可以作为了解乳腺癌患者HER-2 基因扩增及表达的重要筛查方法,对于检测结果为无表达或低表达(0/+)的患者,可以不做FISH 检测,而对于IHC 检测结果为高表达(+++、++)的患者,则需进一步做FISH 检测确诊。

17 号染色体多体的定义尚未形成共识,但多数学者认为当平均每个细胞中的17 号染色体≥3 个时,即17 染色体多体［8］。17 号染色体仅经双探针原位杂交法才能反映,单探针法无法反映。本研究结果显示：17 号染色体多体总发生率为18.00%,IHC 为高表达的17 号染色体多体发生率与低表达或无表达的17 号染色体多体发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。作者认为,17 号染色体的多体可能是造成IHC 与FISH技术检测结果不一致的原因之一,如果存在17 号染色体多体,即使是IHC 检测为+++、++,经FISH 技术检测也可能出现无扩增或低扩增现象,引起假阴性结果,影响临床诊疗。

综上所述,乳腺癌HER-2 基因检测中IHC 与FISH 技术检测的结果一致性较好,但17 号染色体多体可能是导致两种方法检测结果不一致的原因之一,临床医师应结合患者的实际情况选择合适的基因检测方法,FISH 技术可以作为HER-2 基因扩增的确诊手段应用。