黄建溶 彭武建 陈烨

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以免疫性炎症为最主要临床表现的弥漫性结缔组织,病因不明确,发病机制复杂。本研究采用Hiseq-2500 测序SLE 患者及健康者外周血单个核细胞micro RNAs,并进行生物信息学分析,为SLE 的早期诊断与治疗寻找新的线索。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017～2018 年本院及深圳市第三人民医院收治的20 例SLE 患者作为SLE 组,均符合美国风湿病协会1997 年修订的SLE 诊断标准［1］,采用SLE 疾病活动度(SLEDAI)评分评估疾病活动度,均≥5 分,患者平均年龄(37.25±9.70)岁。选取同期20 例健康体检者作为对照组,平均年龄(37.90±9.56)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。该研究计划经本院伦理会批准,所有研究对象均对本研究知情。

1.2 总RNA 的提取、构建文库以及测序 抽取受试者外周抗凝血10 ml,于采血后1 h 使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs),加入Trizol 裂解,提取总RNA 用于小 RNA 建库。样品检测合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit 构建文库。运用Illumina Hiseq-2500 高通量测序平台测序。高通量测序在北京诺禾致源公司协助下完成。

1.3 测序的初步分析 测序所得小RNA 序列经过去污染、去低质量、去接头一系列过程,获得长度区间为18～35 nt 干净小RNA 序列,用bowtie 将长度筛选后的sRNA 定位到参考序列上,分析small RNA 在参考序列上的分布情况。将上述mapped 到参考序列上的reads 与miRBase 中指定范围序列进行比对,得到各样品匹配上的sRNA 的详细情况,包括匹配上的已知miRNA 的二级结构,各样本中miRNA 的序列、长度、出现的次数等信息。

1.4 microRNAs 表达及差异分析 对各样本中microRNAs行表达量的统计,并用TPM 进行表达量归一化处理。microRNAs 在两组样本间的倍比值≥2 且P<0.05,则认为该microRNAs 在两组样本间的表达差异显著。

1.5 生物信息学分析 对每组差异性表达microRNAs的靶基因的集合分别进行GO 和KEGG 富集分析。

2 结果

2.1 两组差异性表达microRNAs 用火山图可以推断差异microRNAs 的整体分布情况,对差异miRNA 进行筛选,结果见图1。SLE 组与对照组比较,表达有差异microRNAs 共有282 种,其中表达上调的有 206 种,表达下调的有76 种。表达上调及下调显著差异的10 例microRNAs 见表1。

2.2 差异性表达microRNAs 靶基因GO 分析 GO富集主要生物学过程、细胞组成、分子功能3 种分类。生物学过程靶基因主要富集在cellular component organization or biogenesis 条目中。细胞组成主要富集在cytoplasm 中。分子功能主要富集在binding 中。显著富集的各个GO term 中的基因数见图2。

2.3 差异性表达microRNAs 靶基因KEGG 分析 差异性表达microRNAs 靶基因共有20 条显著性KEGG信号通路,主要包括Pathways in cancer、PPAR signaling pathway 等信号通路。靶基因KEGG 富集散点图见3。PPAR signaling pathway 信号通路图见图4。

图1 显著差异性表达microRNAs 分析火山图

表1 SLE 组与正常对照组差异性表达的microRNAs

图2 差异性表达microRNAs 靶基因的GO 富集分类

图3 差异性表达microRNAs 靶基因主要聚集的KEGG 通路散点图

图4 PPAR 信号通路的KEGG 通路信号图

3 讨论

本研究采用Illumina Hiseq-2500 测序技术研究系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞microRNAs 与正常对照组差异性表达microRNAs,表达上调的有206 种,表达下调的有76 种。有研究表明miR-127 是影响女性乳腺癌预后的独立因素,miR-127 高表达可以抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长及减少其迁移转移［2］,研究表明SLE 患者中乳腺癌的发病率低［3］。miR-4732-5P 在乳腺癌患者中高表达,可以促进乳腺癌细胞的增值、迁移和侵袭［4］,本研究miR-4732-5P 在乳腺癌患者中低表达。Wen 等［5］研究表明miR-889-3p 上调与结核病患者CD1c 呈负相关,而CD1c 在抗结核免疫中发挥重要作用,而SLE 患者是结核病的高发人群［6］。

KEGG 通路分析结果提示靶基因主要聚集Pathways in cancer、PPAR signaling pathway 等信号通路。Oxer DS 等研究发现PPARγ 可激活CD40,为促炎信号,在活动性的SLE 患者中高表达［7］。

综上所述,SLE 的发生发展机制十分复杂,microRNAs 研究可以作研究SLE 发病机制、寻找特性生物学标志物重要手段之一。