赵俊杰，李 建，李伟杰，姚文生，李 阳，王团结

（1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

猪丹毒（swine erysipelas）是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的传染性疾病。近年来，猪丹毒由散发逐渐呈流行暴发态势，对我国部分地区造成严重的经济损失。同时，作为人兽共患病，动物携带病原感染人的病例接连不断，严重威胁公共卫生安全和动物源性食品安全[1-2]。

目前，在市场流通环节有猪丹毒活疫苗和灭活疫苗。活疫苗以更好的免疫保护效果受到广大养殖场户的青睐，为防控猪丹毒发挥了重要作用。根据《中华人民共和国兽药典》（2015 年版三部）（以下称《兽药典》）规定，猪丹毒活疫苗安全检验使用小鼠或猪进行。从动物试验替代原则和经济成本考虑，优先使用小动物替代大动物开展检验。原猪丹毒活质量标准自1985 年提出至今，虽经修订，但是随着活株疫苗生产代次的提高，使用小鼠进行安全检验的结果稳定性可能会出现问题。同时，影响小鼠免疫反应的几种因素对猪丹毒活疫苗安全检验的影响也不清楚。本研究选用猪丹毒活疫苗（GC42 株），探索小鼠不同品系、性别及体重对安全检验的影响，以期为猪丹毒活疫苗质量标准修订以及企业生产检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

本试验所用猪丹毒活疫苗（GC42 株，产品批号19053001）及20%铝胶生理盐水，均购自广西丽原生物股份有限公司；活菌计数使用的马丁肉汤和马丁琼脂，均购自北京中海生物科技有限公司。

1.2 实验动物

本试验所用SPF 级小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 活菌计数

铺平板：将马丁琼脂融化待温度降至50 ℃左右，按比例加入10%血清后，灌制平板，平板正置放在37 ℃恒温培养箱中过夜，无杂菌生长为合格，待用。

连续稀释与滴平板：按质量标准要求每头份样品应至少含有的活菌数以及样品标示的头份数计算样品稀释倍数。本样品为50 头份的猪丹毒活疫苗冻干苗，每批随机抽样3 瓶，首先分别加入40 mL马丁肉汤充分溶解，各取1 mL 菌液与9 mL 马丁肉汤进行10 倍系列稀释，稀释至10-6稀释度，取10-6稀释度菌液接种在制备好的含10%血清的马丁琼脂上，每瓶样品接种平板3 个，0.1 mL/个，使菌液均匀散开，置37 ℃恒温培养箱中，待平板晾干后，倒置平板，培养48 h。

计算菌数：肉眼观察平板菌落，并在平板底面点数，算出每个样品的3 个平板的平均菌落数，计算出每头份疫苗中含有的活菌数（CFU）。

1.4 安全检验

1.4.1 检验方法 《兽药典》猪丹毒活疫苗质量标准规定，若选用小鼠进行安全检验，需要符合下述要求：按照疫苗标签注明头份，将疫苗用20%氢氧化铝胶生理盐水稀释，皮下注射体重20～22 g小鼠10 只，皮下注射10 只，各2 头份，观察14 d。注射GC42 疫苗的小鼠应全部健活。否则，需用小鼠按照上述方法重检1 次，如果仍不符合规定，可用猪检验1 次。

1.4.2 试验分组

1.4.2.1 小鼠不同品系对安全检验的影响 本试验采用4 种品系小鼠分别为KM、ICR、C57BL/6N和BALB/c，每组10 只，分别按照上述检验方法注射2、6 和10 头份，重复3 次试验。同时，小鼠体重均位于20～22 g 之间，全部为雌性。

1.4.2.2 小鼠不同性别对安全检验的影响 本试验采用雌性和雄性ICR 小鼠（体重20～22 g），每组10 只，分别按照上述检验方法注射2、6 和10头份，重复3 次试验。

1.4.2.3 小鼠不同体重对安全检验的影响 本试验采用13～14、21～22 和29～30 g 雌性ICR 小鼠，每组10 只，分别按照上述检验方法注射2、6 和10 头份，重复3 次试验。

1.5 数据处理

使用SPSS 18.0 统计软件进行单因素方差分析（ANONA），P＜0.05 为差异显著。

2 试验结果

2.1 猪丹毒活疫苗（GC42 株）活菌计数

由表1 可知，活菌计数结果以每批产品3 瓶样品中含活菌数的最小值为最终结果，猪丹毒活疫苗（GC42 株）的活菌计数结果为11.2×108CFU/头份，符合《兽药典》中猪丹毒活疫苗活菌计数中含GC42 活菌应不低于7.0×108CFU/头份的要求。

表1 活菌计数结果

2.2 小鼠不同品系对猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价的影响

由表2 可知，按照《兽药典》的要求，KM、ICR、C57BL/6N 和BALB/c 小鼠接种2 头份猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价一次性通过率均为100%。但是在6 头份和10 头份剂量免疫时，4 种品系小鼠出现差异：KM 小鼠在6 头份剂量组仍保持33.3%通过率；ICR 小鼠在6 头份和10 头份组一次性通过率为0；C57BL/6N 品系小鼠在3 个剂量组未出现小鼠死亡，一次性通过率为100%；BALB/c 小鼠在6 头份和10 头份组一次性通过率为0，且小鼠死亡率显著高于其他各组（P＜0.05）。

2.3 小鼠不同性别对猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价的影响

由表3 可知，在2 头份免疫组，雄性组小鼠出现1 例小鼠死亡，雌性组小鼠3 次试验全部合格；在6 头份和10 头份组，小鼠死亡数量均超过了质量标准要求，同时可见，10 头份组雄性小鼠死亡率显著高于雌性组（P＜0.05）。

2.4 不同体重小鼠对猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价的影响

由表4 可知，21～22 和29～30 g 小鼠免疫2 头份一次性通过率为100%。随着小鼠体重增加，各免疫组小鼠死亡率呈下降趋势。

表2 小鼠不同品系对猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价的影响

表3 小鼠不同性别对猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价的影响

表4 小鼠不同体重对猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全评价的影响

3 讨论

疫苗安全性评价既有疫苗所含抗原本身对实验动物引起的特异性反应，也包含疫苗内的其他成分对机体引发的毒性反应。在进行安全性评价试验时，应在动物死亡时判定是否属于疫苗本身导致的死亡[3]。小鼠是兽用生物制品安全评价最常用的实验动物之一，其稳定性对疫苗安全检验或评价至关重要，而实际工作中发现试验结果常出现结果不稳定、可重复性差等问题。本研究聚焦小鼠品系、性别及体重等诸多因素，比较其对猪丹毒活疫苗（GC42）免疫反应的差异。

动物对各类细菌、病毒等微生物的易感性取决于其主要组织相容性复合体（MHC）。不同品系小鼠对同一微生物的免疫反应可能存在明显差异，如带等位基因H-2b 的小鼠（如C57BL/6N）比带有等位基因H-2k 的小鼠（如C58、C3H）抵抗力强。BALB/c 小鼠极易受到假单胞菌强毒株的感染，而C57BL/6N 小鼠则具有一定抵抗力[4]。本研究表明，C57BL/6N 小鼠对猪丹毒活疫苗（GC42株）的耐受力较其他三种品系小鼠最强，而同为近交系的BALB/c 小鼠最为敏感，试验1 数据显示该组小鼠死亡率100%。按照《兽药典》关于猪丹毒活疫苗安全检验规定，接种2 头份剂量小鼠不能出现因疫苗导致的死亡。本研究证明，4 种品系小鼠均可通过猪丹毒活疫苗（GC42 株）安全检验。

性别也是遗传因素的重要方面。通常认为，雌鼠产生抗体水平通常高于雄鼠，并且维持时间也比雄性小鼠较长。同时，性激素作为内分泌网络的重要一部分与免疫系统存在一定关联[5]。本研究比较了ICR 小鼠雌性和雄性对不同剂量的猪丹毒活疫苗（GC42 株）的耐受能力，结果显示，在2 头份和6 头份剂量组雌性和雄性小鼠均未出现显著差异，但是在10 头份剂量组，雄性小鼠死亡率显著高于雌性小鼠。

在兽用生物制品评价中选择日龄适宜的实验动物是非常重要的。幼龄小鼠免疫系统机能发育不完善或机能很弱，但是成年后随年龄增加免疫反应的活性也减弱[6-7]。本研究还探索了13～14 g 规格小鼠对猪丹毒活疫苗（GC42 株）最为敏感，死亡率显著高于其他各组，无法用于该疫苗的安全检验。随着体重增加，ICR 小鼠对超剂量猪丹毒活疫苗的耐受力也逐渐增加。