马丹妮,马佳雯,赵震震,王正东,曹少谦,戚向阳,*

(1.浙江万里学院生物与环境学院,浙江宁波 315100;2.浙江宁波裕天生物科技有限公司,浙江宁波 315100)

近年来我国水产产量逐年递增,水产资源丰富。其中低值鱼占水产产量的50%～60%,且具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等优点,然而加工比例却不到20%,利用率相对较低,蛋白资源浪费严重[1]。蛋白质是人类健康必不可少的营养物质,具有调节人体水分平衡,增强免疫力,缓解身体疲劳等功能。蛋白粉作为一种新型高蛋白食品,可作为蛋白补充剂为人类机体补充所需蛋白质[2]。目前蛋白粉产品主要以花生蛋白、大豆蛋白等植物蛋白为主。植物蛋白虽然具有良好的加工特性,但由于植物蛋白外周有纤维膜包裹,导致消化吸收率不如动物蛋白高,人体难以将其消化吸收[3]。而动物蛋白主要来源于家禽及鱼类的奶、蛋、肉等,氨基酸成分全面,营养丰富,吸收利用率较高。其中鱼肉蛋白富含游离必需氨基酸,且氨基酸种类接近人体需要,易被人体消化吸收,是一种不可多得的优质食用蛋白[4]。若能以低值鱼类为原料,制备出以鱼蛋白为主的高品质鱼蛋白粉,对于实现低值鱼资源的高值化利用,降低环境污染,缓解水产资源浪费等具有重要的经济效益和社会意义。

然而,目前鱼蛋白粉的制备工艺较落后,未能有效解决产品中存在的腥味重、蛋白含量低、酸价高、易氧化腐败等问题,导致其主要用于饲料加工,难以应用于食品。其原因可能是由于原料鱼自身对外部挥发性有机物的吸收,或因储藏处理不当导致微生物繁殖及酶促作用等原因,使产品存在较浓的鱼腥味[5]。其次,原料鱼多含不饱和脂肪酸,易氧化变质产生异味,从而使产品不易保存,货架期缩短[6]。目前关于高品质鱼蛋白粉制备工艺的研究较少,何建君等利用胰蛋白酶和NaOH对低值鲢鱼蛋白质进行水解,制备液化鱼蛋白粉,蛋白含量达85.1%,但水解液存在一定腥苦味,导致产品口感欠佳[7]。陈海桂等以低值鲐鱼为原料,进行脱腥工艺研究,制备高质量功能性蛋白粉,结果表明用1%的活性炭,在40 ℃下脱腥40 min,制成的鱼蛋白粉蛋白含量高,并含有大量易于人体吸收的游离氨基酸,鱼腥味虽有所减弱,但依旧影响口感,产品品质不高[8]。卢春霞对大黄鱼的脱脂技术进行正交优化试验,结果表明脱脂的最佳工艺参数为:酶量39.50 U/mL、复合盐配比0.27% NaHCO3/1.0% NaCl,脱脂时间为67.62 min,此时脱脂率达40.32%[9]。徐永霞等采用茶多酚溶液对带鱼进行脱腥处理,结果表明带鱼在0.3%茶多酚溶液,40 ℃下浸泡70 min后,腥味成分显著减少[10]。故本文以海洋低值鱼为原料,针对上述鱼蛋白粉腥味重,脂肪易氧化腐败等问题探讨鱼蛋白粉的脱腥、脱脂工艺,以制备无鱼腥味,脂肪氧化程度低,蛋白含量高的可应用于食品的高品质鱼蛋白粉,为低值鱼及水产加工副产物的深度开发及高值化利用提供一定的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜低值鲐鱼 购自宁波市鄞州万达沃尔玛超市;碳酸氢钠、石油醚、浓盐酸、浓硫酸、茚三酮、氢氧化钠、硼酸、三氯乙酸、磷酸组胺、正戊醇、三甲胺盐酸盐等为分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司;碱性脂肪酶(3.0×105U/g) 上海阿拉丁试剂有限公司;混合氨基酸标准溶液(Type H型) 日本和光纯药工业株式会社;茶多酚、β-环状糊精、活性干酵母等为食品级 市售。

GC-2014C气相色谱仪 日本岛津仪器有限公司;Waters e2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司;KDN-12C凯氏定氮仪 浙江托普仪器有限公司;L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司;UGC-12C氮吹仪 北京优晟联合科技有限公司;5804R高速离心机 德国Eppendof;DNP-9272A电热恒温培养箱 上海贺德实验设备有限公司;FE20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;PEN3便携式电子鼻系统 德国Airsense公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼蛋白粉基本生产工艺 将新鲜鲐鱼去头尾、鱼骨、内脏,剥皮,清洗干净后采肉,将鱼肉按料液比1∶2,加入4% NaHCO3,0.5%碱性脂肪酶的复合脱脂剂,30 ℃下脱脂60 min。随后将鱼肉放入90 ℃下水浴加热灭酶30 s,用纱布过滤,洗净沥干。接着按上述方法加入3%酵母,35 ℃下脱腥1.5 h,70 ℃加热1.5 min灭酵母后,纱布过滤后加入4%的茶多酚,40 ℃下脱腥2 h,如此重复脱腥3次,再用纱布过滤鱼肉。处理完毕后将鱼肉放入锅内于98 ℃下蒸煮30 min,用纱布沥干,再压榨鱼肉至无鱼汁流出,于90 ℃下干燥至含水量达10%左右,经粉碎后得鱼蛋白粉。

1.2.2 基本成分分析 水分含量测定采用GB 5009.3-2016直接干燥法[11];灰分含量测定采用GB 5009.4-2016[12];蛋白质含量测定采用GB 5009.5-2016凯氏定氮法[13];粗脂肪含量测定采用GB 5009.6-2016索氏抽提法[14]。过氧化值含量测定采用GB 5009.227-2016滴定法进行检测[15];挥发性盐基氮含量测定采用GB 5009.228-2016半微量定氮法[16];酸价含量测定采用GB 5009.229-2016[17];组胺含量测定采用GB/T 5009.45-2003分光光度法[18]。

1.2.3 鱼蛋白粉复合脱脂工艺正交优化实验 在预实验和前期单因素实验基础上,初步确定NaHCO3和碱性脂肪酶添加量分别为3%～5%和0.4%～0.6%,温度范围为30～50 ℃,在此范围内,鱼肉脱脂率均较高。故选用NaHCO3和碱性脂肪酶作为复合脱脂液对鱼肉进行脱脂。在pH9甘氨酸-NaOH缓冲液,作用时间60 min的条件下,以NaHCO3浓度,碱性脂肪酶酶添加量和作用温度为因素,以脱脂率为指标进行三因素三水平的正交优化实验,因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

脱脂率(%)=(脱脂前原料鱼的含脂量-脱脂后原料鱼的含脂量)/脱脂前原料鱼的含脂量×100

1.2.4 鱼蛋白粉脱腥工艺研究

1.2.4.1 酵母脱腥工艺正交优化 在单因素实验基础上,选用酵母浓度范围2%～4%、作用温度30～40 ℃、作用时间0.5～1.5 h为三因素三水平,以三甲胺含量为指标进行茶多酚脱腥工艺的正交优化实验,因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4.2 茶多酚脱腥工艺正交优化实验 在前期单因素实验基础上,选用茶多酚浓度范围2%～6%、作用温度35～45 ℃、作用时间1.0～2.0 h为三因素三水平。鱼腥味主要由鱼体内氧化三甲胺在微生物和酶的作用下被降解成有腥臭味的三甲胺引起的[19],故以三甲胺为指标进行茶多酚脱腥工艺的正交优化实验,因素水平见表3。

表3 正交试验因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4.3 组合脱腥工艺 结合酵母、茶多酚的最佳脱腥工艺条件,将酵母和茶多酚组合进行脱腥,即先用酵母(3%,35 ℃,1.5 h)脱腥,经70 ℃加热1.5 min灭活酵母后再用茶多酚(4%,40 ℃,2.0 h)脱腥,重复循环4次,测定每次脱腥后鱼肉的三甲胺含量。

脱除率(%)=(脱腥前原料鱼的三甲胺含量-脱腥后原料鱼的三甲胺含量)/脱腥前原料鱼的三甲胺含量×100

1.2.5 三甲胺分析 三甲胺含量测定采用GB 5009.179-2016顶空气相色谱法[20]。

样品前处理:准确称取样品5.0 g于50 mL离心管中,加入20 mL5%三氯乙酸溶液,均质1 min,以4000 r/min离心5 min,取上清液于50 mL容量瓶,残留物依次用15 mL和10 mL5%三氯乙酸溶液重复提取两次,合并滤液并用5%三氯乙酸溶液定容至50 mL,待上机备用[20]。

色谱条件:色谱柱30 m×0.53 mm×1.0 μm,载气2.5 mL/min高纯氮气,进样口温度220 ℃,升温程序40 ℃保持3 min,以30 ℃/min速率升至220 ℃,保持1 min,检测器温度220 ℃,尾吹气35 mL/min氮气,氢气流量40 mL/min,空气流量400 mL/min。

1.2.6 氨基酸分析 总氨基酸样品前处理:分别取5 g鱼蛋白粉和浓盐酸于25 mL水解管中,氮吹封口,110 ℃恒温消解22 h,消解结束后高纯水定容至25 mL,滤纸过滤,弃去初滤液,取0.2 mL滤液,氮吹至干,加2 mL 0.02 mol/L盐酸溶液溶解,涡旋混匀后,取适量溶液过0.22 μm滤膜,即得到待测液,待上机分析[21]。

检测参数:分离柱(内填日立专用离子交换树脂,4.6 mm ID60 mm 3 μm),分离柱柱温55 ℃,梯度洗脱,洗脱液流速0.30 mL·min-1,反应柱(内填金刚砂惰性材料,4.6 mm ID40 mm)柱温130 ℃,反应液茚三酮流速0.30 mL·min-1,检测波长570和440 nm,进样量20 μL,样品分析周期为50 min。

1.2.7 鱼蛋白粉营养评价 鱼蛋白粉的氨基酸评分、化学评分分别按以下公式计算:

氨基酸评分(AAS)=样品氨基酸含量/WHO/FAO评分标准模式氨基酸含量

1.2.8 电子鼻分析 取0.5 g鱼蛋白粉,置于10 mL顶空瓶中,加盖密封一段时间,通过电子鼻检测系统检测,样品的检测参数为清洗时间60 s,零点调节时间5 s,连接样品时间5 s,测量时间120 s,进样流量300 mL· min-1,采用WinMuster软件对稳定后第113～114 s数据进行主成分分析(PCA)[22]。

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 原料鱼基本成分分析

如表4所示,低值原料鱼蛋白含量为17.59%,高于鳙鱼(蛋白含量15.96%)[6]、鳀鱼(蛋白含量16.71%)[23]等鱼肉蛋白,表明原料鱼蛋白含量丰富,是制备鱼蛋白粉的良好来源。而脂肪含量高达15.35%,且所含脂肪大多为易氧化腐败、产生刺激性气味的不饱和脂肪酸[24],极易使制备鱼蛋白粉产生异味,品质下降,严重影响货架期。因此,为制备高品质鱼蛋白粉,需对原料鱼进行脱脂处理。

表4 原料鱼基本成分(%)Table 4 Basic ingredients of raw fish(%)

2.2 复合脱脂工艺正交优化试验

由表5、表6可知,复合脱脂效果的各因素影响大小为:A(NaHCO3浓度)>C(酶添加量)>B(温度),其中,因素A(NaHCO3浓度)和C(酶添加量)对鲐鱼肉脱脂率有显著性影响(P<0.05),B(时间)的影响不显著(P>0.05)。综合以上分析结果,NaHCO3和碱性脂肪酶复合脱脂的最佳工艺条件为A2B1C2,即NaHCO3浓度4%,作用温度30 ℃,酶添加量0.5%。在此条件下,原料鱼的脱脂率达48.74%。

表5 复合脱脂工艺正交试验表Table 5 Orthogonal test results of compound degreasing process

表6 正交试验方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 酵母脱腥工艺正交优化试验

由表7、表8可知,酵母脱腥的各因素影响大小为:A(酵母浓度)>B(作用温度)>C(作用时间),其中,因素A(酵母浓度)和B(作用温度)对鲐鱼三甲胺含量有显著性影响(P<0.05),C(作用时间)的影响不显著(P>0.05)。根据K值大小,酵母最佳脱腥条件为A2B2C3,即酵母浓度3%,作用温度35 ℃,作用时间1.5 h。在此条件下,原料鱼三甲胺含量可降至62.20 mg·kg-1。

表8 试验方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment

表7 酵母脱腥工艺正交试验表Table 7 Orthogonal test results of deodorization process with yeast

2.4 茶多酚脱腥工艺正交优化试验

由表9、表10可知,茶多酚脱腥效果的各因素影响大小为:A(茶多酚浓度)>B(温度)>C(作用时间),其中因素A(茶多酚浓度)和因素B(作用温度)对鲐鱼三甲胺含量有显著性影响(P<0.05),C(作用时间)的影响不显著(P>0.05)。综合以上分析结果,茶多酚最佳脱腥条件为A2B2C3,即茶多酚浓度4%,作用温度40 ℃,作用时间2 h。在此条件下,可将原料鱼三甲胺含量(109.42 mg·kg-1)降低至68.52 mg·kg-1。

表9 茶多酚脱腥工艺正交试验表Table 9 Orthogonal test results of deodorization process with tea polyphenol

表10 正交试验方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiment

2.5 组合脱腥工艺试验

由图1可知,随着脱腥次数的增加,原料鱼中三甲胺含量明显降低(P<0.05),但处理三次后,再增加脱腥次数,原料鱼中的三甲胺含量无明显变化(P>0.05)。三次组合脱腥处理后,鱼肉中三甲胺含量仅为52.13 mg·kg-1,脱除率达到52.36%,明显降低原料鱼腥味。

图1 酵母-茶多酚组合脱腥处理效果Fig.1 Deodorizing effect of combination of yeast and tea polyphenols 注：不同小写字母表示具有显著性差异(p<0.05)。

2.6 鱼蛋白粉品质分析

2.6.1 鱼蛋白粉一般理化指标 如表11所示,经脱腥、脱脂工艺处理后制备的鱼蛋白粉蛋白含量显著增加,远远高于未经处理制备的鱼蛋白粉(49.55%),且脂肪含量、酸价、POV值、挥发性盐基氮以及组胺的含量也大大降低,表明经过处理后制备的鱼蛋白粉品质大大提升。组胺被认为是毒性最大的一类生物胺物质,人体过度摄入会出现头痛、呕吐等不良症状[25],也是评价水产制品腐败程度的重要指标,检测鱼蛋白粉的组胺含量对产品的可食用性具有重要意义[26]。未经处理制备的鱼蛋白粉其组胺含量相对较高,但未超过鱼粉[27]国标一级鱼粉的组胺限量标准(组胺≤300 mg/kg),而经处理后制备的鱼蛋白粉组胺含量大大降低,仅为27.47 mg/kg,这可能是由于酵母在利用腥味物质发酵脱腥的过程中,部分组胺也参与了酵母的发酵反应[28],表明处理后鱼蛋白粉腐败程度降低,安全性提高。同时处理后的鱼蛋白粉基本成分均达到鱼粉[27]国标中一级鱼粉标准:水分≤10%,粗灰分≤16%,粗蛋白≥65%,粗脂肪≤11%,酸价≤3 mg/g,挥发性盐基氮≤110 mg/100 g,组胺≤300 mg/kg,其蛋白含量也达到大豆蛋白粉[29]国标标准(粗蛋白≥50%)。

表11 鱼蛋白粉理化指标Table 11 Physical and chemical index of fish protein powder

2.6.2 鱼蛋白粉氨基酸分析 由表12可知,处理后制备的鱼蛋白粉氨基酸总量达59.202 g/100 g,明显高于未经处理制备的鱼蛋白粉氨基酸总量的39.773 g/100 g,主要体现在天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸等氨基酸含量的增加。其中赖氨酸是人体必需氨基酸之一,可增强人体免疫力,促进身体发育,有提高中枢神经组织功能[30]。此外,苯丙氨酸、组氨酸是苦味氨基酸,天冬氨酸和谷氨酸是鲜味氨基酸[31],而处理后制备的鱼蛋白粉中苯丙氨酸、组氨酸含量下降,天冬氨酸和谷氨酸含量增加,表明脱腥脱脂工艺不仅可脱除鱼蛋白粉部分腥苦味,还可适当提升鱼蛋白粉鲜味。另外处理后制备的鱼蛋白粉必需氨基酸总量为24.086 g/100 g,占氨基酸总量的40.68%,根据WHO/FAO推荐的理想模式认为,蛋白质必需氨基酸与总氨基酸之比在40%左右被认为是质量较好的蛋白质[32]。说明处理后制备的鱼蛋白粉蛋白品质高,是一种优良的蛋白补充剂,可有效补充人体所缺蛋白质。

表12 处理前后鱼蛋白粉氨基酸分析(g/100 g)Table 12 Amino acid analysis of fish(g/100 g)protein powder before and after treatment

2.6.3 鱼蛋白粉营养评价 由表13可知,处理后制备鱼蛋白粉的氨基酸评分、化学评分均高于未经处理制备的鱼蛋白粉,表明处理后制备的鱼蛋白粉中的必需氨基酸模式更接近人体氨基酸需要量模式,是一种营养价值较高的蛋白质。从AAS和CS看,处理后制备的鱼蛋白粉中缬氨酸评分最低,故鱼蛋白粉的第一限制氨基酸为缬氨酸,而评分最高的是赖氨酸,表明鱼蛋白粉中赖氨酸含量相对丰富。

表13 鱼蛋白粉氨基酸评分和化学评分(g/100 g)Table 13 Amino acid score and chemical score of fish protein powder

另外大部分谷物粗粮的第一限制氨基酸是赖氨酸,同时富含缬氨酸[33]。由此可见,处理后制备的鱼蛋白粉可以与五谷杂粮形成互补,有助于提高鱼蛋白粉营养价值。

2.6.4 电子鼻分析鱼蛋白粉挥发性气味成分 利用电子鼻PCA分析未经处理制备的鱼蛋白粉、处理后制备的鱼蛋白粉的气味成分变化,当2个贡献率之和大于85%,且贡献率越大,说明产品的气味成分越能较好被区分[34]。如图2所示,两种鱼蛋白粉的第一主成分和第二主成分的贡献率分别为96.31%、3.58%,两个主成分贡献率之和达99.89%,能用来表征未经处理制备的鱼蛋白粉、处理后制备的鱼蛋白粉的整体气味特征,且两种鱼蛋白粉的气味成分能很好被区分。从PC1轴看,处理后制备的鱼蛋白粉气味主成分未经处理制备的鱼蛋白粉右侧。从PC2轴看,处理后制备的鱼蛋白粉气味主成分分布比未经处理制备的蛋白粉得广,这种变化说明两种鱼蛋白粉的挥发性气味变化非常显著,且处理后制备的鱼蛋白粉气味成分更加丰富。

图2 鱼蛋白粉PCA分析Fig.2 PCA graphs of fish protein powder

3 结论

通过正交优化实验确定了制备鱼蛋白粉的最佳脱脂工艺条件为在30 ℃温度下,采用4%NaHCO3和0.5%碱性脂肪酶的复合脱脂液脱脂60 min;随后用3%酵母在35 ℃下脱腥1.5 h,再用4%茶多酚在40 ℃下脱腥2.0 h,重复脱腥3次,最后将处理的鱼肉于90 ℃温度下进行热风干燥。该条件下制备的鱼蛋白粉蛋白含量高,脂肪含量低,无鱼腥味,且组胺含量低,氨基酸含量丰富,必需氨基酸模式接近人体所需氨基酸模式,蛋白质品质良好。表明鱼肉经脱腥、脱脂处理后所制备的鱼蛋白粉具有较好的营养食用安全性,是一种优良的蛋白补充剂,该研究可有效提高低值鱼资源的高值化利用率,降低环境污染。