徐兵，李蕾，陈贵元

(1.大理大学临床医学院，云南 大理；2.重庆市涪陵中心医院，重庆；3.大理大学基础医学院，云南 大理；4.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理）

0 引言

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，由RB1 基因的突变引起[1]。其发病率约1：20000，大多数患儿发病年龄小于5 岁[2-3]。由于RB 具有潜在致盲性甚至危及生命，因此可给家庭及社会造成严重的负担[4-5]。玛卡（西班牙语：Maca，学名：LepidiummeyeniiWalp），是一种十字花科植物，主产于秘鲁东南部安第斯山脉，我国主要分布于云南迪庆、丽江等高寒山区[6-7]。其有改善性功能、提高生育能力、抗疲劳以及治疗更年期综合症等作用。多糖普遍存在于生物体内，具有抗肿瘤、抗菌、降血糖、调节免疫等多种作用[8-9]。本文旨在研究玛卡多糖对体外培养的Y79 细胞增殖、凋亡的影响以及其作用机制，为进一步研究玛卡多糖的抗肿瘤作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玛卡多糖的提取参考李月、陈贵元等[10]的研究方法进行提取；Y79 细胞株（北京北纳创联生物技术研究院）；RPMI 1640 培养基及胎牛血清（美国Thermo scientific 公司）；增强型CCK8 试剂盒（碧云天生物技术公司）；细胞周期检测试剂盒（四正柏生物）；Trzol（Vazyme Biotech Co.，Ltd）；逆转录试剂盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd）；ChamQTM SYBR® qPCR Master MiX（Vazyme Biotech Co.，Ltd），PCR 引物（金斯瑞生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理

Y79 细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。玛卡多糖溶解于RPMI 1640 培养基，过滤除菌后-20℃保存备用。

1.2.2 细胞增殖检测

Y79 细胞被制成1×105个/mL 细胞悬液，接种于96 孔板上，每孔为100μl；对照组加入RPMI 1640 完全培养基100μl，实验组加入溶有玛卡多糖的完全培养基100μl，终浓度分别为0.5、1、2、4mg/mL，每个浓度设置3 个复孔，分别培养24、48、72 小时。培养结束前4h，每孔加入增强型CCK8 试剂20μl，再于培养箱中孵育4 小时后以酶标仪在450nm 波长下检测各孔吸光光度值（OD），计算细胞存活率。实验重复三次。细胞存活率=[实验组吸光光度值-空白组吸光光度值/对照组吸光光度值-空白组吸光光度值]×100%。

1.2.3 细胞周期检测

收集Y79 细胞，实验组以终浓度为1mg/mL 玛卡多糖干预细胞，对照组加入等体积完全培养基。培养48 小时后，取1X106 个细胞以预冷的PBS 洗涤两次后以75%乙醇4℃固定过夜，离心后加入100μl RNaseA，37℃水浴30min，加入400μl PI，4℃避光孵育30min 后上机检测。实验重复3 次。

1.2.4 荧光定量PCR 检测CDK1、CyclinB1 的表达

收集实验组（玛卡多糖终浓度1mg/mL）和对照组（加入等体积完全培养基），培养48 小时后的Y79 细胞，以Trzol 试剂提取总RNA 后进行逆转录合成cDNA，使用ChamQTM SYBR® qPCR Master MiX 进行扩增。以β-actin 为内参，引物见表1，反应条件：95℃预变性5min、95℃变性15s、55℃退火15s，72℃延伸60s，循环40 次后分析各样本Ct 值，然后采用2-ΔΔCt 计算基因的相对表达量。以上步骤均按试剂说明书进行。实验重复3 次。

表1 荧光定量PCR 引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 玛卡多糖对Y79 细胞增殖的影响

不同浓度的玛卡多糖处理Y79 细胞不同时间后，实验组各组的细胞存活率均低于对照组，且随时间及玛卡多糖浓度的增加生存率逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05 或0.01）。表明，玛卡多糖可抑制Y79 细胞增殖。详见图1、表2。

2.2 玛卡多糖对Y79 细胞周期的影响

由图2 可知，1.0mg/mL 玛卡多糖Y79 细胞干预48h 后，流式细胞术检测细胞周期分布发现，相比于对照组，实验组Y79 细胞G2/M 期分布比例明显增高（P＜0.01）。详见图2、表3。表明，玛卡多糖可促使Y79 细胞周期停滞于G2/M 期。

图1 玛卡多糖对Y79 细胞增殖能力的影响

表2 玛卡多糖在不同浓度和时间点Y79 细胞的存活率（n=3，

表2 玛卡多糖在不同浓度和时间点Y79 细胞的存活率（n=3，

注：与对照组相比，*P＜0.01，# P＜0.05。

组别（mg/mL） 细胞生存率（%）24h 48h 72h 0.0 94.39±1.57 95.39±1.45 94.37±1.70 0.5 86.81±1.57# 55.71±2.30* 44.70±1.49*1.0 60.46±3.08* 32.08±1.58* 16.67±2.27*2.0 40.42±0.85* 21.23±1.88* 11.13±1.46*4.0 30.38±1.26* 14.50±1.25* 7.46±0.89*F 值 701.776 1080.155 1499.379 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图2 流式细胞术检测Y79 细胞的周期分布

表3 流式细胞术检测Y79 细胞周期的分布（n=3，

表3 流式细胞术检测Y79 细胞周期的分布（n=3，

注：与对照组相比，* P＜0.01

分组 G0/G1（%） S（%） G2/M（%）阴性组 53.39±2.58 42.43±2.88 2.02±0.28 *玛卡多糖组 41.05±2.30 46.96±3.68 9.61±1.25 *

2.3 玛卡多糖对Y79 细胞CDK1、CyclinB1 mRNA 表达的影响

荧光定量PCR 结果显示，与对照组相比，1.0mg/mL 玛卡多糖处理Y79 细胞48h 后，CDK1、CyclinB1 在mRNA 水平表达显著降低（P＜0.05），表明玛卡多糖可抑制Y79 细胞CDK1、CyclinB1在mRNA 水平的表达。详见图3。

图3 玛卡多糖对Y79 细胞CDK1、CyclinB1 mRNA 表达的影响

3 讨论

近年来，随着个体化综合治疗以及眼底筛查等手段的开展，较多RB 患儿可获得早期诊断及治疗，这大大提高了患儿的生存率，但在很多欠发达国家和地区，生存率仍较低[11,12]。目前化疗仍是临床上广泛运用的方法，而大多数诸如卡铂等化疗药物可引起胃肠道不适、暂时性脊髓抑制和继发性白血病等不良反应[13]，同时出现的肿瘤耐药性限制了其临床应用。由于RB 患儿大多数小于5 岁，这就要求化疗药物必须安全、有效。玛卡作为我国的传统中药，长期运用于临床治疗多种疾病，具有安全、廉价等特点。因此我们探索了玛卡多糖的抗RB 活性及机制。

经玛卡多糖处理后，通过检测Y79 细胞存活率发现，玛卡多糖可抑制细胞增殖。玛卡多糖浓度由低到高，细胞增殖抑制逐渐增加，而随着时间的延长，细胞增殖抑制率亦逐渐增加。表现出明显的浓度与时间依赖性。通过细胞周期检测发现实验组Y79 细胞G2/M 期比例高于对照组。因此，我们推测，Y79 细胞存活率的下降可能与玛卡多糖促进细胞周期阻滞有关。

细胞周期调控蛋白CyclinB1 是Cyclin 家族的重要成员，通过与激酶CDK1 形成复合物后可引起下游的RB 蛋白磷酸化，RB 蛋白磷酸化后便失去了对转录因子E2F 的抑制活性，继而E2F 恢复活性并加速细胞周期由G2 期进入M 期[14,15]。

通过荧光定量PCR 检测，我们发现实验组Y79 细胞的CDK1和CyclinB1 在mRNA 的表达上明显低于对照组，而CDK1 和CyclinB1 是细胞周期通路中调节G2/M 期的关键蛋白。因此，我们认为玛卡多糖可能通过下调CDK1、CyclinB1 的表达来促使Y79 细胞停滞在G2/M 期，从而导致细胞的凋亡。

总的来说，玛卡多糖具有抗RB 活性，其可能的作用机制为通过调节细胞周期信号通路来实现。玛卡多糖作为一种全新的药物，有望成为治疗视网膜母细胞瘤的有效或辅助药物。接下来我们将在动物水平进一步验证其抗RB 活性。