吴祎培，张 羽，陈 曦，冯希平

龋病是造成婴幼儿牙齿疼痛及牙齿缺失的主要原因之一。由于儿童生长发育和牙齿生理与解剖的特点，致使儿童龋病与成人相比病损波及范围更广泛，进展更迅速，危害更大。2017年第四次全国口腔健康流行病学调查结果显示，中国5岁儿童的患龋率为70.9%，与10年前相比呈上升趋势[1]。

微生物因素被普遍认为是龋病的发生发展中一个重要因素[2]。龋病发生后，口腔内的部分细菌对不断变化的环境有更强的适应能力，从而成为优势菌群[3-4]，同时唾液组成的变化也影响着口腔微生物群的平衡失稳[5-6]。本次研究基于MiSeq测序平台构建口腔微生物的16s rRNA基因文库进行高通量测序，旨在对不同龋易感性母亲的婴儿在不同时期的唾液微生物组群多样性特征进行系统发生学表征和比较，观察微生物多样性的差异及变化，进一步认识微生物多样性与婴幼儿龋病之间的关系，为预测低龄儿童龋提供一定的依据，也为早期儿童龋病的预防与预测提供健康指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象的选择

对2016年8月份至2017年11月份在上海市浦东新区惠南镇社区卫生服务中心儿童保健科建卡妊娠期女性筛查随访。纳入婴儿及其母亲共10对，根据婴儿1个月月龄(1月龄)时对母亲的龋病临床检查结果分为母亲有龋组(7对)与母亲无龋组(3对)，其中男性婴儿6例，女性4例。纳入标准：母亲及婴儿无系统性疾病以及先天性疾病；母亲口腔除龋病外无其他疾病；婴儿为足月生产儿；婴儿及母亲1月龄至6个月龄(6月龄)随访前两周内未使用抗生素；婴儿出生后未接受任何口腔治疗。上海交通大学医学院附属第九人民院伦理委员会批准通过该研究(伦理批号：2015-135)，自愿参与该研究的婴儿母亲均签署知情同意书。

1.2 口腔临床检查与唾液样本的收集

母亲的口腔临床检查主要包括恒牙牙冠状况、可视菌斑、牙龈探诊出血、牙周袋深度及附着丧失。口腔临床检查由一名经培训的检查者完成。在调查实施前，按照WHO《口腔健康调查基本方法》第5版[7]中的龋病标准和釉质发育缺陷标准，由参考检查者对检查者进行龋病和牙周检查标准的培训。

所有受试者要求取样前1小时禁止进食及饮水，婴儿唾液样本的收集使用无菌棉签提取婴儿口内的唾液，4～5根完全浸湿的棉签，保存至提前准备好的灭菌后的5 mL离心管中。所取唾液样品立刻置于干冰内，确保3 h内转移至实验室，-80 ℃冰箱冻存备用。两组受试者于1月龄时及该婴儿6月龄随访时分别收集唾液样本。

1.3 微生物多样性分析

所有样本经过总基因组DNA样本制备及PCR扩增构建测序文库，MiSeq测序平台测序并对数据质控过滤校正得到优化数据。在97%的序列相似水平下进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的聚类划分并完成生物信息统计，获得样本在不同的分类学水平下群落组成信息。

1.4 测序结果分析

采用Alpha多样性分析(Shannon指数)反映婴儿在1月龄至6月龄时口腔内物种群落丰度和多样性丰富的变化。通过Venn图表现各组样本中的物种OTU数目组成相似性及重叠情况。通过Beta多样性分析 (主成分分析，principal component analysis，PCA)分析了解样本间物种组成的相似程度。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 软件(version23.0，IBM,美国) 比较两组口腔临床检查数据的差异，计量资料采用独立t检验，计数资料采用 Fisher’s 精确检验，所有统计分析均为双侧检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床检查结果

对无龋组与有龋组母亲进行的口腔临床检查结果如表1所示，无龋组与有龋组母亲在龋失补指数与龋失补牙面数存在显著性差异。而无龋组与有龋组母亲的牙龈指数与牙周探诊深度均无明显差异。

表1 无龋组与有龋组母亲口腔临床检查情况比较

2.2 OTU分布分析

以Venn图统计多组样本中OTU的数目及分布情况(图1)。有龋组OTU的数目总体高于无龋组。由下图可看出无龋组1月龄、无龋组6月龄、有龋组1月龄、有龋组6月龄4组婴儿OTUs(OTU的种类)分别有106、142、609、392种，其中无龋组1月龄至6月龄共有种类为64种，有龋组1月龄至6月龄共有种类为322种，1月龄时无龋组与有龋组之间共有种类为89种，6月龄时无龋组与有龋组之间共有种类为123种。

2.3 Alpha多样性分析

为反映不同样本中微生物群落的多样性，我们通过Shannon指数分析得到各样本Alpha多样性柱状图，无龋组在1月龄至6月龄期间口腔内微生物多样性均有了不同程度的增长，有龋组虽然组内同月龄下口腔内微生物多样性有所差异，但在1月龄至6月龄期间口腔微生物的多样性均有增加。1月龄时有龋组婴儿口腔内微生物多样性总体高于无龋组，6月龄时有龋组婴儿口腔内微生物多样性总体也高于无龋组。

negative1代表1月龄无龋组，positive1代表1月龄有龋组，negative6代表6月龄无龋组，positive6代表6月龄有龋组

A：无龋组1月龄与6月龄婴儿唾液Venn图；B：有龋组1月龄与6月龄婴儿唾液Venn图；C：1月龄有龋组与无龋组婴儿唾液Venn图；D：6月龄有龋组与无龋组婴儿唾液Venn图

图14组受试者OUT分布Venn图

Fig.1Venn plot of OUT distribution of subjects of four groups

negative1代表1月龄无龋组；positive1代表1月龄有龋组；negative6代表6月龄无龋组；positive6代表6月龄有龋组

A：无龋组1月龄与6月龄婴儿唾液Alpha多样性柱状图；B：有龋组1月龄与6月龄婴儿唾液Alpha多样性柱状图；C：1月龄有龋组与无龋组婴儿唾液Alpha多样性柱状图；D：6月龄有龋组与无龋组婴儿唾液Alpha多样性柱状图

图2各组受试者Alpha多样性(Shannon指数)

Fig.2Comparison of Shannon microbial diversity index in each group

2.4 Beta多样性分析及比较

OTU水平下比较各组的Beta多样性可见，无龋组各个样本1月龄时较聚集，6月龄时较分散，无龋组在1月龄至6月龄时组内物种组成有较大差异(图3A)；有龋组在1月龄与6月龄时在图中的点均较分散，可见有龋组各样本间在不同时期物种组成组内均差异较大，且这种差异从1月龄时就开始体现(图3B)；1月龄有龋组与1月龄无龋组各样本反映在图中的点多数聚集在同一区域，此时多数样本的微生物物种组成较为相似(图3C)；而至6月龄时，无龋组与有龋组各样本不同组别间的物种组成已经开始发生了变化(图3D)。

negative1代表1月龄无龋组；positive1代表1月龄有龋组；negative6代表6月龄无龋组；positive6代表6月龄有龋组

A：无龋组1月龄与6月龄婴儿唾液PCA分析;B：有龋组1月龄与6月龄婴儿唾液PCA分析;C：1月龄有龋组与无龋组婴儿唾液PCA分析;D：6月龄有龋组与无龋组婴儿唾液PCA分析

图3受试者PCA分析

Fig.3Principal component analysis of the genus information

本研究由于无龋组与有龋组之间人数不等，故可通过PLS-DA进行比较分析，进一步了解两组间微生物的物种构成与物种的相似性。通过PLS-DA在OTU水平下的分析可得到图4，图中每个点即代表一个样本，如样本物种组成越相似，点与点反映在PCA图中的距离越近。图中可看出无龋组1个月与无龋组6个月部分样本在图中所反映的点较密集，即组内各样本间物种组成较相似，有龋组1个月与有龋组6个月在图中所反映的点较分散，组内各样本间物种组成差异较大。

3 讨 论

当前，低龄儿童患龋率居高不下。在龋病的病因学说中，“生态菌斑假说”这一理论得到了越来越多的学者们的认同[8-9]，细菌是龋病发生发展过程中的关键因素[10 ]，迄今为止还没有一种有效的方法可以提前预见或控制该疾病的发生发展。本研究分别通过对1月龄与6月龄时婴儿唾液中的微生物多样性分析，纵向观察婴儿期口腔内微生物的群落结构及微生物丰度，为了解低龄儿童龋(early chil-dhood caries，ECC)的病因和发病机制提供了更广泛的视角，为低龄儿童龋口腔菌群多样性变化的纵向研究提供相关信息，为儿童龋病风险评估和预测提供理论依据。

positive1代表有龋组1月龄；positive6代表有龋组6月龄；negative1代表1月龄无龋组；negative6代表6月龄无龋组

图4PLS-DA分析图

Fig.4Partial least squares discriminant analysis

在相似水平为97%的OTU水平下，无龋组1月龄、有龋组1月龄的OTUs分别为106与609种，而在无龋组6月龄与有龋组6月龄中OTUs为142与392种，同月龄时相比较有龋组OTU的数目总体高于无龋组。Alpha多样性分析中发现有龋组与无龋组在1～6个月的过程中各组的物种丰度均有了不同程度的增长。有多项研究表明，患有ECC的儿童与无龋儿童相比，口内生物多样性存在着显著的差异[10-11]，无龋儿童口腔中微生物多样性明显高于ECC儿童，ECC组在龋发生前微生物多样性呈明显下降趋势[12-14]。Tao等对于患有ECC的婴儿口腔微生物多样性的纵向研究中，32个月时有龋组微生物的物种丰度显著低于无龋组。这可能是由于在儿童生命的早期阶段，口腔内物种多样性呈一个上升趋势[15-16]，牙齿萌出后，在唾液的影响下，优势菌群的数量逐渐增加[17-19]，致龋细菌在牙齿表面定殖并形成口腔生物膜的一部分，他们可能会随着时间的推移变得相对稳定从而影响其他微生物的物种丰度，进而导致微生物多样性的下降[20-21]。

为了比较样本间微生物组成结构与群落之间的差异，我们通过PCA分析了解样本间物种组成的相似程度。OTU水平下的PCA分析显示无龋组在1月龄时样本间物种组成并无显著性差异，但在1月龄至6月龄的过程中物种组成有差异性变化；而有龋组1月龄与6月龄各样本间物种组成差异较大，且这种差异从1月龄时就开始体现。这表明无龋组相较于有龋组在物种组成及群落结构方面更稳定。

本研究同样也存在不足与一定的局限性。如样本量较少导致研究结果可能存在偏倚，对口腔内微生物多样性的变化不能做到全面、辩证的认识；此外，此次研究没有对影响龋病发生发展的变异链球菌等进行针对性检测。本研究结果作为纵向研究的一部分，后续也将继续对更高月龄的婴儿唾液样本中微生物群落构成与丰度随访及分析，而对于重要致龋菌-变异链球菌的检测及观察其变化等将在后续研究中涉及。