叶 青 曾 静

(1 湖北省中西医结合医院眼科，武汉市 430015，电子邮箱：gxykdxyq@126.com；2 广西医科大学第一附属医院眼科，南宁市 530000)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是一种具有高度增殖能力、定向分化潜能及低免疫原性的成体干细胞，是理想的种子细胞来源，常被用于眼表损伤的修复，其显著的抗炎性、免疫调节功能及神经营养功能又使其在多种视网膜疾病的治疗中发挥重要作用。BMSC在眼科领域的研究日渐增多，为多种眼部疾病的治疗提供了新方向。本文就BMSCs的生物学特性及在眼科领域的研究进展进行综述。

1 BMSCs的生物学特性

1.1 生长特性及形态特征 1968年，Friedenstein等[1]发现在骨髓中除造血干细胞外还存在一种呈纺锤形、成纤维细胞样的贴壁单核细胞，这种细胞参与调控造血干细胞的成熟并促进其进入外周循环系统。随后Friedenstein等[1]体外培养发现，此种细胞可形成克隆集落单位，且具有潜在分化潜能，这种细胞即为BMSC。研究表明，间充质干细胞在骨髓中的分布极少，每104～105个骨髓细胞中仅约含1个BMSC。Deans等[2]发现，BMSC可传至40代而分化能力无明显变化，即按照其指数生长期的倍增时间(30～33 h)来算，增殖1亿倍时其干细胞特性仍可保留。

1.2 分离纯化 目前，BMSC的分离方法主要有密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪技术、磁珠分选技术，前两种较常用于分离，后两种多用于鉴定。(1)密度梯度离心法：骨髓中的红细胞、白细胞、单核细胞的密度不同，用特定的淋巴细胞分离液将细胞离心、分层，收集单核细胞层，即为BMSC。常用的淋巴细胞分离液有Percoll和Ficoll两种。目前此法最为常用，但是对离心速度有一定要求，过快易损伤细胞，过慢分层效果差、纯度不高。(2)贴壁筛选法：骨髓中BMSC贴壁生长，其余红细胞、白细胞及造血干细胞为悬浮生长，因此可使用骨髓冲洗液直接通过换液、传代的方法筛选出BMSC。此法操作简单，但需要不断换液去除其他细胞，且因部分成纤维细胞也能贴壁生长，BMSC纯度不高。(3)流式细胞仪技术：由于BMSC体积小、缺少表达标志物，虽可用流式细胞仪分选，但对细胞活性影响较大，且价格昂贵。(4)磁珠分选技术：将BMSC与含有单克隆抗体的免疫磁性微粒特异性结合形成磁珠-细胞复合体，利用磁场作用，将复合体吸附于磁场中，进而与其他细胞成分分离，但由于BMSC表面缺乏特异性标志物，因此分离效果欠佳。

1.3 鉴定 BMSC表面缺乏特异性标志物，因此大多通过形态特征、免疫表型、生长特点、分化能力等进行鉴定，也可通过排除法进行推断，如实验中使用流式细胞仪对BMSC进行鉴定的最低标准是(标准培养条件下)：能够贴壁呈梭形生长，能够表达CD29、CD44、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD79α、CD11b、人类白细胞DR抗原等[4]。

1.4 表面标记 BMSC不仅表达间充质细胞的表面标记物，还兼具肌细胞、内皮细胞的表面特征。BMSC可表达多种表面标记物， 如黏附分子、生长因子、细胞因子、受体与整合素，但是迄今未发现独特的BMSC表面标记物。当前已经研究成熟的BMSC阳性表达分子有CD44、纤维连接蛋白、CD90、CD29、CD105、CD13、CD133[5-9]。

1.5 诱导分化 研究表明，BMSC具有高度分化潜能，已被体外诱导为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、内皮细胞、骨髓基质细胞以及神经元样细胞等[10-12]。营养条件、细胞浓度、生长因子、组织因子都会影响BMSC的分化方向。BMSC既可向间充质组织细胞分化，也可向非间充质组织细胞分化，这一分化潜能为疾病治疗提供了多种组织来源。在眼科研究领域，已将BMSC定向分化为上皮样细胞[13-15]，作为种子细胞修复上皮损伤；或将BMSC分化为神经元、神经胶质细胞[16]或视网膜色素上皮细胞[17]等用于视网膜移植治疗。

2 BMSC的治疗机制

2.1 抗炎性 Thomas等[18]发现，与BMSC共同培养的自然杀伤细胞分泌干扰素的能力，是单独培养的自然杀伤细胞的2.5～4倍，证实BMSC具有抗炎作用；Brandau等[19]发现，BMSC通过调节中性粒细胞的抗微生物免疫环境，抑制炎症反应。

2.2 免疫调节性 Tomchuck等[20]发现，BMSC通过表达Toll受体，激活下游核因子κB、蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶信号，产生白细胞介素等细胞因子，促进免疫调节。

2.3 损伤修复性 Kim等[21]发现，BMSC不仅可以促进受损组织再生，还可促进受损的中枢及外周神经系统的功能恢复；Qu等[22]发现，BMSC可促进损伤的肠黏膜修复；Basiouny等[23]发现，BMSC促进表皮、真皮、毛囊的再生。

2.4 旁分泌功能 BMSC分泌神经保护因子和血管生成因子，如睫状神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子β等[24]。

2.5 归巢机制 归巢是指在多种因素作用下，BMSC趋向性迁移至炎症或损伤部位并定植的过程。Xiao等[25]给肝脏损伤的大鼠模型注射被标记的BMSC，发现趋化因子受体4与其配体基质细胞衍生因子1促使BMSC向损伤肝脏迁移。

3 BMSC与眼表疾病

3.1 BMSC与角膜损伤 角膜损伤时，具有修复能力的角膜缘干细胞缺失及角膜上皮的“结膜化”，诱发新生血管生成及炎症反应，最终导致角膜瘢痕形成。传统的治疗方法主要有抗炎、促进角膜愈合、板层角膜移植、单纯羊膜移植等，但供体来源有限且异体移植排异反应强烈。BMSC因其抗炎、抗新生血管生成、可定向分化为类角膜上皮的潜能及归巢作用，逐渐被应用于角膜损伤的治疗。

Oh等[26]局部应用BMSC治疗碱烧伤动物模型，发现BMSC可分泌血小板反应蛋白1，同时降低VEGF和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)的表达水平，从而抑制炎症相关新生血管生成。Yao等[27]给碱烧伤大鼠模型结膜下注射BMSC，发现BMSC可通过旁分泌途径抑制早期炎症反应，并发挥其抗新生血管生成的作用。卞丹梅等[28]将BMSC种植于羊膜上，然后移植至碱烧伤大鼠角膜，发现BMSC可通过调节碱烧伤相关炎症因子(白细胞介素2、白细胞介素10、转化生长因子β、MMP-2、VEGF等)减轻炎症反应。刘国华等[29]使用BMSC治疗碱烧伤大鼠后，大鼠角膜新生血管及炎症细胞均减少，大鼠眼表得以重建；吴利安等[30]发现，在角膜碱烧伤初期移植自体BMSC可减少多形核中性粒细胞浸润，减轻角膜炎症，下调或抑制MMP-2在受损角膜处的表达，并抑制基质胶原纤维的降解，从而减少碱烧伤后角膜溃疡的发生。Roddy等[31]将BMSC通过静脉或腹腔注射入碱烧伤大鼠体内后，其角膜浑浊程度和炎症反应减轻，这一机制可能与碱烧伤后的角膜上皮细胞可激活BMSC分泌多能抗炎蛋白肿瘤坏死因子α，从而刺激多能抗炎蛋白肿瘤坏死因子α刺激基因6分泌有关。以上研究表明，BMSC有助于减轻损伤角膜的炎症反应，促进修复。Lan等[32]给予热损伤模型大鼠静脉注射被标记的BMSC，72 h后在受损角膜中发现BMSC，而空白对照侧眼角膜中并未检测到BMSC，说明通过静脉输注的BMSC可被募集至角膜损伤部位。

3.2 BMSC与角膜移植 BMSC可作为种子细胞，与不同载体共同建立人工角膜用于角膜移植。目前常用的BMSC的载体主要为羊膜、脱细胞猪角膜基质及各种生物材料。Holan等[13]比较了BMSC和角膜缘干细胞在纳米支架上的生长、分化和分泌特性，证实两者对碱烧伤兔角膜具有相似的治疗效果。Sun等[14]将眼发育相关的人配对盒基因6基因转染大鼠间充质干细胞中，并移植到角膜缘干细胞缺陷(limbal stem cell deficiency，LSCD)兔模型，转染后21 d，转染的大鼠间充质干细胞表现出角膜样上皮细胞的特征性石板样外观，并发现大鼠间充质干细胞可转化为角膜样上皮细胞。Rohaina等[15]利用角膜缘介质将BMSC诱导至角膜谱系。10 d后用于LSCD模型的治疗，发现BMSC可被诱导成角膜上皮谱系，并在LSCD模型中重建角膜。

BMSC不仅可以分化为类角膜细胞，还可以抑制角膜移植后排斥反应，其机制可能与BMSC的免疫调节作用有关。Treacy等[33]发现，BMSC通过抑制外周免疫应答和调节移植物内免疫环境，来延长角膜移植物的存活时间。

4 BMSC与眼后段疾病

4.1 糖尿病视网膜病变 导致糖尿病可直接导致视网膜神经细胞、胶质细胞及小胶质细胞发生病理性改变，引起视网膜微血管病变，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)主要表现为视网膜缺血缺氧和血管通透性增加。

Ritter等[34]认为，BMSC在缺血性损伤视网膜中可向损伤部位迁移并分化为内皮细胞、小胶质细胞及星形胶质细胞；Tomita等[35]发现，BMSC能够分化为视网膜细胞和血管内皮细胞，从而保护光感受器细胞。利焕廉等[36]对DR大鼠模型行尾静脉注射BMSC，发现密集的BMSC集中存在于视网膜外核层；且随干预时间延长，大鼠血糖浓度逐渐下降，同时， 在视网膜中BMSC明显向光感受器细胞及胶质细胞分化。这提示BMSC可降低DR大鼠血糖，在一定程度上修复血-视网膜屏障。刘凌[37]发现，对DR患者行静脉注射BMSC后，房水及全身VEGF165水平下降，且VEGF165/VEGF165b比值下降，这提示BMSC可通过调节VEGF165/VEGF165b比例调控眼部新生血管相关因子的表达，抑制视网膜新生血管形成。Çerman等[38]对糖尿病大鼠右眼静脉注射绿色荧光蛋白标记的BMSC，发现BMSC主要整合到视网膜内并分化为胶质细胞，且振动电位波振幅明显增加。而DR患者的视网膜电图最常见的早期改变就是振动电位波振幅减小和隐形时间延长。Yang等[39]发现，BMSC可以通过分化成视网膜中的光感受器和胶质样细胞，并通过降低血糖水平来改善糖尿病大鼠血-视网膜屏障的完整性；张杰等[40]将未分化的BMSC移植入糖尿病大鼠视网膜，发现部分BMSC可分化为视网膜细胞，虽然这些细胞不能精确表达神经样蛋白，但可修复损伤并改善振动电位波b波。

4.2 早产儿视网膜病变 早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)是由于早产儿和低体重儿抗氧化体系不全，高氧条件下视网膜微血管易受氧自由基损伤而导致的病变，其同时存在视网膜新生血管生成视网膜神经细胞的凋亡。

赵岩松等[41]将BMSC移植入ROP大鼠模型，发现BMSC可通过促进视网膜细胞中神经营养因子3和睫状神经营养因子蛋白的表达，减少ROP大鼠视网膜细胞的凋亡。牟青杰等[42]将BMSC注射于氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)新生大鼠模型的玻璃体腔内，7 d后视网膜缺氧诱导因子1α和VEGF水平显著降低，且视网膜大血管排列整齐，无灌注区明显减少，这表明BMSC可通过抑制缺氧诱导因子1α及VEGF蛋白的表达来减少OIR新生大鼠视网膜新生血管的形成。此外，Wang等[43]将BMSC注射入OIR小鼠玻璃体腔内，发现小鼠新生血管区域及视网膜中央血管闭塞区域面积明显减少。

4.3 视网膜变性性疾病 视网膜色素变性是一系列以感光细胞及色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)进行性功能丧失为共同表现的视网膜退行性疾病，致病原因多样，目前尚无有效治疗方法[44]。年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是随年龄增长出现的双侧视网膜黄斑部进行性退行性病变，氧化应激引起视网膜功能紊乱及缺失在AMD中起重要作用[45]。视网膜色素变性和AMD均累及RPE和光感受器细胞。

赵雯等[46]将BMSC移植于大鼠视网膜下，光照24 h建立光感受器损伤模型，10 d后发现，与视网膜下注射生理盐水相比，视网膜下注射BMSC可减少光感受器细胞凋亡。Peng等[47]发现BMSC可被诱导分化为RPE，表达RPE细胞表面标记物的同时具有吞噬感光细胞膜盘的功能。杨娟等[48]将GAP43基因转染至BMSC后注射于大鼠视网膜下，30 d后发现视网膜厚度明显增加且视紫红质表达增多，说明GAP43基因修饰的BMSC移植能增加光感受器细胞存活率，延缓视网膜变性。Jian等[49]发现BMSC移植后可分泌神经因子调节Müller细胞功能，减少组织损伤。Wang等[50]将BMSC从尾静脉注射至视网膜色素变性的大鼠模型体内，发现未经处理的对照组大鼠只剩一层光感受器细胞，而BMSC组大鼠的杆状及锥状光感受器均保留，且血管渗漏面积小，生长因子、神经营养因子较多。Arnhold[51]等将BMSC移植入敲除视紫红质的小鼠体内，发现BMSC不仅融合至RPE及神经鞘层，还延长了光感受器存活时间。王宝英等[52]通过尾静脉注射和玻璃体内注射的方式给视网膜色素变性模型小鼠移植BMSC，发现两种方式均可修复损伤视网膜的形态结构，并能改善其电生理功能。Huo等[53]发现经视网膜下注射的BMSC可向视网膜感光细胞和RPE分化。

4.4 视网膜缺血再灌注损伤 视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)常见于青光眼、视网膜血管阻塞性疾病以及影响视网膜血流的手术术后患者中，由钙超载及氧自由基连锁反应引发细胞凋亡，其中凋亡相关因子(apoptosis-related factor,Fas)/Fas配体(Fas ligand，FASL)的膜受体死亡通路是其关键性调控因素。Rosenbaum等[54]发现在RIRI大鼠脑中Fas/FasL表达增高，同时神经元细胞的凋亡与Fas/FasL表达位置一致。曹永亮等[55]发现视网膜下移植BMSC可使RIRI大鼠视网膜中凋亡相关蛋白Caspase-3、Fas/FasL表达减少，进而减轻视网膜神经节的凋亡。

此外，Wang等[43]发现，在RIRI大鼠模型中，玻璃体腔内注射BMSC的大鼠视网膜厚于注射磷酸盐缓冲液的大鼠视网膜。赵岩松等[56]证实视网膜下移植与玻璃体腔内移植BMSC均能显著减轻RIRI，但经视网膜下移植的效果更为显著。

4.5 青光眼 青光眼是视网膜的神经退行性病变，主要病理改变为神经节细胞丢失。BMSC可上调神经营养因子的生成及分泌，诱导损伤部位神经纤维再生；此外，BMSC还可分化为分泌更高水平脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子和VEGF的神经营养因子分泌间充质干细胞，从而保护视神经。Manuguerra-Gagné等[57]对激光诱导的开角型青光眼大鼠模型进行前房注射BMSC后，发现BMSC可通过旁分泌作用降低眼内压、促进祖细胞池活化、诱导小梁网再生。Johnson等[58]证实局部应用BMSC对大鼠青光眼模型具有视神经保护作用，经玻璃体腔注射的BMSC使青光眼大鼠视神经轴突存活率提升了30%。Roubeix等[59]发现BMSC 经前房注射入青光眼样高眼压模型大鼠后，大鼠眼压显著降低，并推测其可能的机制如下：(1)BMSC通过激活抗凋亡途径蛋白激酶B促进人小梁网细胞的存活；(2)人小梁网细胞随着肌球蛋白磷酸化的降低而松弛；(3)人小梁网细胞不能转化生长。

4.6 自身免疫性葡萄膜炎 自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis，EAU)发病机制复杂，多种炎症因子参与其中，目前主要使用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。而BMSC的免疫调节作用为EAU的治疗提供了另一种可能。Oh等[60]通过给EAU小鼠模型腹腔注射BMSC，发现BMSC可通过抑制Th1/Th17，上调白细胞介素10，增加B220+CD19+细胞数量来抑制EAU发展。Lee等[61]给EAU小鼠模型静脉输注BMSC，发现BMSC通过趋化因子2依赖的方式将髓源性抑制细胞募集到炎症部位，从而抑制EAU。

5 小 结

干细胞疗法已成为眼科学领域新的研究方向，BMSC研究虽已经取得一定的进展，但仍存在一些问题尚待解决，例如随个体年龄的增长，自身BMSC的分化潜能降低，如何解决自体移植受限；如何准确鉴定在体外分离、纯化培养的BMSC；BMSC分化不定向，如何诱导其在体内定向分化；当BMSC作为移植物时其最佳移植数量、最佳移植时间、其免疫调节机制等。但是我们相信随着科技的进步、检测手段的更新以及科研工作者的共同努力，BMSC在眼科领域的研究和应用前景会更加广阔。