余腾飞 唐年初 刘诚毅

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 海南博禾农业发展有限公司，海南 海口 570100)

忧遁草学名鳄嘴花(Clinacanthusnutans)，又被称为沙巴蛇草、青箭等，爵床科鳄嘴花属，广泛分布于华南热带至马来西亚、爪哇、加里曼丹，在中国海南、广东、广西和云南等地的低海拔疏林或灌丛内均有分布。研究表明，忧遁草具有抗高血脂活性[1]、免疫活性[2-3]、抗氧化性[4-5]、抗癌特性[6-7]和抗菌特性[8]等生物活性。忧遁草含有较丰富的多糖，而关于忧遁草多糖的相关研究报道较少，仅Huang等[9]从忧遁草中分离出了一种多糖—肽复合物，并表明该复合物具有免疫调节作用。

目前，多糖的提取方法有热水浸提法、酶辅助提取法[10]、超声提取法[11]、微波辅助提取法[12]、超临界流体萃取法[13]、超声微波协同提取法[14]和超高压提取法[15]等。相比之下，热水浸提法成本低且安全，在实际的多糖提取中应用最为广泛。试验拟采用热水浸提法提取忧遁草多糖，并对多糖的抗氧化性进行评价，为忧遁草多糖的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

忧遁草：海南博禾农业有限公司；

粉末活性炭：阿拉丁试剂有限公司；

ABTS、DPPH：西格玛奥德里奇(上海)贸易公司；

无水乙醇、硫酸、苯酚、过硫酸钾、抗坏血酸、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水:分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪：RE5203型，上海亚荣仪器厂；

冷冻干燥机：LGJ-18型，北京四环科学仪器厂有限公司；

电热恒温震荡水槽：DKZ型，上海一恒科学仪器有限公司；

分光光度计：UVmini-1240型，日本岛津公司；

高速多功能粉碎机：HC-350Y型，永康市天祺盛世工贸公司。

1.3 试验方法

1.3.1 忧遁草多糖提取工艺路线

鲜叶采摘→晒干→粉碎机粉碎过40目筛→按一定比例加入去离子水提取→趁热过滤得上清液→60 ℃减压浓缩→加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜→将沉淀物经丙酮、无水乙醇各洗两次→冻干得粗多糖

1.3.2 葡萄糖标准曲线绘制 根据SN/T 4260—2015的葡萄糖标准曲线测定方法，得回归方程y=64.361x+0.001，R2=0.999 4。

1.3.3 多糖提取率计算 按式(1)计算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——多糖提取率，%；

C——稀释后的多糖浓度，mg/mL；

V——复溶多糖溶液的体积，mL；

N——稀释倍数；

m——忧遁草粉末质量，mg。

1.3.4 单因素试验

(1) 提取时间：称取忧遁草粉末5.000 g，固定料液比1∶25 (g/mL)，提取温度80 ℃，考察提取时间(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)对忧遁草多糖提取率的影响，3次平行。

(2) 料液比：称取忧遁草粉末5.000 g，固定提取时间1.5 h，提取温度80 ℃，考察料液比[1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]对忧遁草多糖提取率的影响，3次平行。

(3) 提取温度：称取忧遁草粉末5.000 g，固定料液比1∶30 (g/mL)，提取时间1.5 h，考察提取温度(60，70，80，90，100 ℃)对忧遁草多糖提取率的影响，3次平行。

1.3.5 响应面优化 在单因素试验基础上，以料液比、提取温度和提取时间为因素，多糖提取率为响应值，进行三因素三水平响应面试验设计，采用Box-Behnken响应面法优化忧遁草多糖提取工艺。

1.3.6 忧遁草多糖抗氧化性研究

(1) 对ABTS自由基的清除能力：参考Xu等[16]的方法并略作修改。将15 mL ABTS溶液(7 mmol/L)与15 mL 过硫酸钾溶液(5 mmol/L)混合，暗处静置12 h，用去离子水稀释至734 nm处吸光度为0.70±0.02。将0.5 mL 粗多糖溶液分别稀释成0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL，与制备的ABTS溶液(3 mL)混合，室温下震荡10 min，测定734 nm处吸光度值。以去离子水代替多糖溶液作为空白对照，以去离子水代替ABTS溶液作为样品对照，以抗坏血酸(VC)为阳性对照，按式(2)计算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

Y——自由基清除率，%；

A0——空白对照组吸光度值；

A1——样品试验组吸光度值；

A2——样品对照组吸光度值。

(2) 对DPPH自由基的清除能力：参考Xu等[16]的方法并略作修改。分别取2.0 mL浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的粗多糖溶液，与3 mL新制备的0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合并反应30 min，测定517 nm处吸光度值。以乙醇溶液代替多糖溶液作为空白对照，以去离子水代替DPPH溶液作为样品对照，以抗坏血酸(VC)为阳性对照，按式(2)计算DPPH自由基清除率。

(3) 对羟基自由基的清除能力：参考王丽霞等[17]的方法并略作修改。分别取2.0 mL浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL多糖溶液，与2.0 mL硫酸亚铁溶液(6 mmol/L)、水杨酸—乙醇溶液(6 mmol/L)、双氧水(6 mmol/L)混匀，静置20 min，测定510 nm处吸光度值。以去离子水代替双氧水作为空白对照，以去离子水代替多糖溶液作为样品对照，以抗坏血酸(VC)为阳性对照，按式(2)计算羟基自由基清除率。

1.4 数据处理

采用Design-Expert V8.0.6、OriginPro 8.5和Excel 2016等软件对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1可知，随着提取时间的增加，多糖提取率先上升后趋于稳定，提取时间为1.5 h时达到峰值，可能是0.5～1.5 h多糖溶解不充分，而溶解完全后，提取时间对忧遁草多糖提取率的影响变弱，从而使多糖提取率趋于稳定[18]。随着液料比的增加，多糖提取率先迅速增长后趋于平稳，料液比为1∶30 (g/mL)时达到峰值，可能是传质阻力随着液料比的增加而不断减小，多糖扩散速率加剧；而在料液比达到1∶30 (g/mL)后，多糖溶液已趋于饱和，溶剂作用不再显著，因此多糖提取率趋于稳定[19]。随着提取温度的升高，多糖提取率先迅速增长后缓慢下降，可能是60～90 ℃的升温过程破坏了忧遁草的细胞膜结构，加快了多糖从细胞中释放；当温度超过90 ℃时，多糖被氧化，分子结构受到破坏的现象越来越严重，引起多糖提取率下降[20]。

2.2 响应面法优化多糖提取工艺

2.2.1 回归模型的建立与方差分析 以忧遁草多糖提取率为响应值，以料液比、提取温度和提取时间为变量，设计三因素三水平优化试验，试验因素及水平表见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

图1 各因素对忧遁草多糖提取率的影响

表1 试验因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

由软件分析可得二次回归方程：

Y=-41.875+0.958 5A+0.632 62B+1.932 5C-0.001 75AB+0.041AC-0.002 0BC-0.014 1A2-0.003 15B2-0.92C2。

(3)

由表3可知，模型P<0.000 1，表明此模型具有显著性；失拟项P为0.162 6，即失拟项不显著；拟合度为0.990 9，说明该模型与实际情况拟合较好；校正拟合系数为0.979 2，表明该回归方程能真实反映3个因素与多糖提取率间的关系；A、B、C、AB、AC、A2、B2和C2对提取率的影响极显著；各因素对多糖提取率的影响依次为提取时间>提取温度>料液比。

表3 方差分析表†

2.2.2 各因素间的交互作用 由图2可知，料液比和提取温度、料液比和提取时间的曲面坡度较陡，且各自的等高线呈椭圆形，表明AB、AC的交互作用对多糖提取率影响显著；提取温度和提取时间的响应曲面坡度较小，且等高线呈圆形，表明BC间的交互作用对多糖提取率影响不显著；交互作用分析结果与方差分析结果吻合。

2.2.3 最佳工艺验证 通过Design-Expert 8.0.6软件分析可知，忧遁草多糖的最佳提取工艺为料液比1∶30.79 (g/mL)，提取温度91.58 ℃，提取时间1.644 h，该条件下预测的多糖提取率为3.48%。根据实际操作的可行性，选择料液比1∶31 (g/mL)，提取温度92 ℃，提取时间1.6 h为最终的工艺条件，此时实测多糖提取率为3.40%(n=3)，与预测值较接近。

图2 两因素的交互作用对多糖提取率的影响

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 对ABTS自由基的清除效果 由图3可知，ABTS自由基清除率随忧遁草多糖浓度的增大先迅速增大后趋于平缓。当忧遁草多糖浓度为3 mg/mL时，ABTS自由基清除率为94.93%，IC50为0.981 mg/mL。多糖对ABTS自由基的清除效果与VC相当，说明忧遁草多糖对ABTS自由基具有良好的清除效果。

图3 忧遁草多糖对ABTS自由基的清除曲线

Figure 3 Scavenging ability of crude polysaccharide ofClinacanthusnutanson ABTS free radical

2.3.2 对DPPH自由基的清除效果 由图4可知，DPPH自由基清除率随忧遁草多糖浓度的增大先迅速增大后趋于稳定，当忧遁草多糖浓度为3 mg/mL时，清除率达83.49%，IC50为2.449 mg/mL。结合对照组VC的清除效果可知，忧遁草多糖具有良好的DPPH自由基清除效果。

图4 忧遁草多糖对DPPH自由基的清除曲线

Figure 4 Clearance curve of polysaccharide ofClinacanthusnutanson DPPH free radical

2.3.3 对羟基自由基的清除效果 由图5可知，羟基自由基清除率与忧遁草多糖浓度呈正相关，当忧遁草浓度为3 mg/mL时，清除率达67.20%，IC50为1.461 mg/mL。结合对照组VC的清除效果可知，忧遁草多糖具有一定的羟基自由基清除能力。

图5 忧遁草多糖对羟基自由基的清除曲线

Figure 5 Clearance curve of polysaccharide ofClinacanthusnutanson OH free radical

3 结论

试验采用热水浸提法提取忧遁草多糖，并优化了忧遁草多糖的提取工艺。结果表明，忧遁草多糖的最佳提取工艺条件为料液比1∶31 (g/mL)，提取温度92 ℃，提取时间1.6 h，此条件下多糖提取率为3.40%。抗氧化试验结果表明，忧遁草多糖具有良好的ABTS自由基和DPPH自由基清除效果，并具有一定的羟基自由基清除能力，说明忧遁草多糖可作为一种具有开发潜力的天然抗氧化剂新资源。后续可深入研究忧遁草多糖的结构及功效。