邓之奎， 朱伟

(1. 江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013； 2. 淮安市第一人民医院血液科实验室， 江苏 淮安 223300)

近年来，随着化疗、造血干细胞移植、免疫治疗、分子靶向治疗等技术的进步，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者大多能获得完全缓解，标准的一线诱导化疗方案能够使60%～80%的年轻患者以及40%～60%的老年患者获得缓解，然而，仍有60%的患者缓解后面临复发的风险[1]。耐药是AML患者治疗失败、生存率低的关键因素[2]，然而AML耐药的确切机制尚不完全明确。近年来，AML耐药机制的研究主要集中在耐药相关蛋白及酶异常、基因突变、miRNAs的改变以及耐药相关信号通路的异常活化[3]。本研究以AML患者骨髓单个核细胞(BMMNC)以及AML细胞系为研究对象，探讨miR-155-5p对AML细胞凋亡的影响及可能机制，为临床克服AML患者化疗耐药、提高疗效提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 BMMNC采集

收集本院2016年1月至2018年12月43例AML患者，诊断标准参照WHO急性白血病临床分型(2016)，所有患者均经细胞形态学、免疫分型、细胞遗传学和分子学(MICM)确诊。患者的中位年龄36(18～75)岁，男24例，女19例。采用Ficoll密度梯度离心法分离出BMMNC，分装至1.5 mL EP管内(每管细胞数约1×106)，保存于-80 ℃低温冰箱。对照组为21例缺铁性贫血患者。标本采集经淮安市第一人民医院医学伦理委员会批准，并获得患者本人知情同意。

1.2 细胞系及培养

HL-60、THP-1细胞系购于美国ATCC细胞库(美国Virginia公司)，用含有10%胎牛血清、100 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基(美国Invitrogen公司)于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，每隔48～72 h换培养液1次，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 试剂

Bcl-2抗体(美国Proteintech公司)；NF-κB(p65)抗体、β-肌动蛋白抗体、羊抗鼠IgG-HRP抗体、羊抗兔IgG-HRP抗体(美国Cell signaling Technology公司)；ECL检测发光试剂盒(美国Bioworld Technology公司)；细胞凋亡试剂盒(德国MiltenyiBiotec公司)；总蛋白提取试剂盒(南京诺唯赞公司)；qRT-PCR相关的逆转录及扩增试剂盒(中国Vazyme公司)；PVDF膜(中国凯基生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁生物科技有限公司)；miR-155-5p转染试剂盒(上海生工生物科技有限公司)。

1.4 qRT-PCR检测BMMNC中miR-155-5p和Bcl-2 mRNA的表达

Trizol法提取BMMNC的总RNA，通过逆转录试剂盒，Oligo引物及逆转录酶将总RNA逆转录为cDNA。miR-155-5p特异引物为5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′；Bcl-2上游引物为5′-CCCCACAGTCTACTGTAAG-3′，下游引物为5′-GCATTGCCGATGGTACTGATT-3′；β-肌动蛋白上游引物为5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物为5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。定量PCR(美国应用生物系统公司7300扩增仪)反应程序为95℃ 3 min，95℃ 30 s，40个循环，62℃ 40 s。扩增结果以β-肌动蛋白作为内参基因，采用ΔΔCt法计算相对定量。

1.5 细胞转染

miR-155-5p类似物：5′-GAUAGUUCGGUGUGCACA-3′,miR-155-5p类似物对照:5′-AUGGUCGUUAAGCCAGUG-3′；miR-155-5p抑制剂：5′-CGGAUAUGUGCAGUGCUA-3′,miR-155-5p 抑制剂对照：5′-AGGCAGUGUCGUCAAUUG-3′。依据转染试剂盒说明书，取对数生长期的HL-60、THP-1细胞分别接种于6孔板，次日细胞汇合度达30%～50%时，加入混匀后的脂质体2000和miR-155-5p类似物或抑制剂，室温孵育30 min，置于37℃、5%CO2的孵育箱中转染6 h后换液，继续培养48 h。qRT-PCR验证转染效率，方法同步骤“1.4”。

1.6 CCK-8法检测HL-60和THP-1转染细胞的活性

取转染后处于对数生长期的HL-60、THP-1细胞，以4×104/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔体积为100 μL。加入不同浓度的化疗药物阿糖胞苷(终浓度为0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64和1.28 μg/mL)，置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育48 h，弃去上清液，每孔中加入100 μL PBS和10 μL的WST-8试剂，避光37℃温箱孵育2 h后用酶标仪检测光密度(D)值，检测波长为480 nm。每个浓度设置3个复孔。

1.7 流式细胞术检测HL-60和THP-1转染细胞的凋亡率

将转染后的HL-60、THP-1细胞以每孔1×105个的密度接种于6孔板中，各设3个复孔，待细胞贴壁后，加入阿糖胞苷(0.16 μg/mL)处理48 h后，用酶消化法收集细胞于1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心10 min，PBS洗涤1次，每管加入200 μL结合液、5 μL Annexin V试剂和10 μL PI试剂，避光室温孵育10 min后置于冰上。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 qRT-PCR法检测转染miR-155-5p抑制剂后HL-60和THP-1细胞NF-κB、Bcl-2的mRNA表达

Trizol法提取转染miR-155-5p抑制剂后HL-60和THP-1细胞的总RNA，通过逆转录试剂盒，Oligo引物及逆转录酶将总RNA逆转录为cDNA。NF-κB上游引物为5′-CCTATGTGGAGATCATTGAGCA-3′，下游引物为5′-CAAAGATGGGATGAGAAAGGAC-3′；Bcl-2上游引物为5′-CCCCACAGTCTACTGTAAG-3′，下游引物为5′-GCATTGCCGATGGTACTGATT-3′；β-肌动蛋白上游引物为5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物为5′-GCTGGAAGGTGGACA GCGA-3′。定量PCR(美国应用生物系统公司7300扩增仪)反应体系：上下游引物各1 μL、Taq DNA聚合酶12.5 μL、模板cDNA 2 μL、去离子水8.5 μL，总反应体系25 μL。扩增条件：95℃预变性3 min，94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环，72℃ 5 min。扩增结果以β-肌动蛋白作为内参基因，采用ΔΔCt法计算相对定量。

1.9 蛋白质印迹法检测转染miR-155-5p抑制剂后HL-60和THP-1细胞NF-κB、Bcl-2的蛋白表达

6孔板每孔用1 mL PBS洗涤1次，置于冰上，每孔加入70 μL含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，细胞刮刀顺同一方向将转染miR-155-5p抑制剂后的AML细胞轻轻刮下，吸取每孔中的蛋白裂解液至1.5 mL EP管中，振荡器振荡混匀1 min，置于冰上10 min后继续振荡1 min，重复3次，4℃、12 000×g离心15 min后吸取上清液至新EP管中，按照4 ∶1的比例加入5×上样缓冲液，水浴煮沸8 min，-20℃短期保存。取50 μg蛋白质为上样量，先经80 V恒压电泳，当蛋白进入积层胶时将电压调至100 V恒压电泳，待蛋白跑至胶底部后以350 mA恒流电转2 h，将PVDF膜浸于5%脱脂牛奶中封闭1 h，分别加入一抗(NF-κB、Bcl-2、β-肌动蛋白，稀释比例1 ∶1 000)，4℃孵育过夜。次日以TBST洗涤3次，每次10 min，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(稀释比例1 ∶2 000)，37 ℃温育1 h，最后，加入Millipore的曝光液(A液和B液按1 ∶1的比例混合)，采用化学发光凝胶成像系统进行检测。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表达

qRT-PCR结果显示AML患者较缺铁性贫血患者BMMNC的miR-155-5p和Bcl-2 mRNA表达明显升高(图1)。

图1 miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表达

2.2 miR-155-5p对阿糖胞苷处理的HL-60和THP-1细胞活性和凋亡的影响

HL-60细胞转染miR-155-5p类似物或抑制剂后，qRT-PCR检测转染效率，miR-155-5p表达较对照组有明显差异(F=124.7，P<0.01)，见图2A。CCK-8及流式检测结果显示转染miR-155-5p类似物的HL-60细胞经阿糖胞苷处理后细胞活性较对照组增加，细胞凋亡率明显减少(t=6.806,P<0.01)；而转染miR-155-5p抑制剂组细胞活性降低，凋亡率明显增加(t=3.790,P<0.01)，见图2B、C。qRT-PCR检测THP-1细胞转染miR-155-5p类似物或抑制剂转染效率，miR-155-5p表达较对照组有明显差异(F=295.3，P<0.01)，见图3A。阿糖胞苷处理后转染miR-155-5p类似物的THP-1细胞活性增强，凋亡率减少(t=4.487,P<0.01)；转染miR-155-5p抑制剂的THP-1细胞活性降低，凋亡率增加(t=16.01,P<0.01)，见图3B、3C。

图2 miR-155-5p对阿糖胞苷处理的HL-60细胞活性和凋亡的影响

图3 miR-155-5p对阿糖胞苷处理的THP-1细胞活性和凋亡的影响

2.3 抑制miR-155-5p后HL-60和THP-1细胞NF-κB、Bcl-2表达减少

qRT-PCR和蛋白质印迹结果显示，HL-60细胞转染miR-155-5p抑制剂后，NF-κB、Bcl-2在mRNA水平与蛋白水平的表达均下降(P均<0.05)，见图4A、4B。用THP-1细胞重复上述实验进行验证也发现同样的结果(P均<0.05)，见图4C、4D。表明miR-155-5p可能通过上调NF-κB、Bcl-2抑制AML细胞凋亡。

图4 抑制miR-155-5p对HL-60、THP-1细胞NF-κB、Bcl-2表达的影响

3 讨论

研究发现miRNAs主要通过调控DNA损伤、细胞周期以及细胞凋亡等介导肿瘤耐药[4-6]。研究表明，miR-155在多种肿瘤组织中表达异常，并与临床病理标志物、肿瘤分型和较低的存活率相关，能够介导多种信号通路，包括NF-κB信号通路，NF-κB可直接结合miR-155的启动子调控miR-155的表达。miR-155参与多种生理学过程，包括造血细胞分化、免疫反应、炎症以及肿瘤治疗耐药[7-8]。miR-155在多种实体肿瘤的发病机制中起着至关重要的作用，Bayraktar等[7]通过对乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌6个实体肿瘤的540个样本的miRNA表达谱进行分析，发现miR-155的表达在乳腺癌、肺癌和结肠癌样本中上调，并可促进包括乳腺癌和肺癌在内的几种癌症的肿瘤细胞生长、细胞迁移、侵袭以及上皮间质转化。

miR-155除了在实体瘤的发生及耐药中发挥重要作用外，也参与多种血液肿瘤的发病及耐药。miR-155是血液系统肿瘤最具有特征性的致癌miRNA，包括弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、合并FLT3-ITD基因突变的AML[9-12]。高表达的miR-155可以显著增强肿瘤细胞活性，同时降低白血病细胞对化疗药物的敏感性[7]。研究证实miR-155在成人与儿童AML中高表达，特别是FLT3-ITD突变的AML，且高表达miR-155的AML患者预后较差[13]。本研究通过分析AML患者临床样本发现miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中表达明显增高。

为了进一步验证miR-155-5p在AML细胞生长及凋亡中的作用，在AML细胞系中，分别转染miR-155-5p类似物与miR-155-5p抑制剂，发现转染miR-155-5p类似物组细胞活性增加、凋亡减少，而转染miR-155-5p抑制剂组细胞活性降低、凋亡增加，提示miR-155-5p可以提高AML细胞活性、抑制其凋亡。同时，在转染miR-155-5p抑制剂的AML细胞中，NF-κB、Bcl-2的mRNA和蛋白水平表达均降低，提示miR-155-5p促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，并抑制AML细胞凋亡。

综上，本研究结果显示miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表达，在AML细胞中miR-155-5p可以促进AML细胞对阿糖胞苷的抗性、抑制其凋亡，miR-155-5p可能通过促进NF-κB、Bcl-2的表达抑制AML细胞凋亡。因此，miR-155-5p或可作为提高AML治疗效果的分子靶标。