吴凯，陈钦明，王健俊，何继贤，余岱岳，路羿，杨六成

（南方医科大学珠江医院 小儿外科，广东 广州 510282）

先天性巨结肠（hirschsprung disease, HD）又称无神经节细胞症，是儿童最常见的消化道畸形之一，发病率为0.02%～0.05%，并有逐年增加的趋势[1]。其发生的主要原因是远端肠管神经节细胞缺如，目前其发病机制仍未完全阐明[2]。MicroRNA（miRNA）被认为是后基因时代最大的宝库，其通过直接降解靶基因或者调节靶基因的翻译，参与生命过程中一系列重要的病理生理过程，包括细胞增殖、分化、迁移及凋亡等[3]。 miRNA在HD中同样具有重要作用，如miR-483-5p、miR-215及miR-206等均被证实可通过影响细胞功能参与HD的发生、发展[4-7]。通过基因芯片及实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）发现，miR-145-3p在HD病变段肠管高表达[8]。本研究将进一步明确miR-145-3p在HD中的具体作用，探索其分子机制，为其应用于HD的诊治提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 组织标本选取2013年2月—2018年6月南方医科大学珠江医院40例HD病变段肠管（HD病变肠管组）及40例正常肠管（正常肠管组）组织标本。人神经母细胞细胞株SH-SY5Y由南方医科大学珠江医院麻醉科馈赠，为中国科学院上海研究所细胞库提供。所有HD患儿行钡灌肠及病理检查明确诊断，而正常肠管均经病理证实无异常。所有标本各收集2份，获取后迅速置于液氮中冻存。本研究通过医院伦理委员会批准，患儿家属知情同意。

1.1.2 主要试剂Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，miRNeasy微量抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miR-145-3p引物及miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供，CCK-8购自江苏碧云天生物技术公司，GDNF一抗及羊抗鼠二抗购自美国Abcam公司，miR-145-3p mimics及阴性对照由广州锐博生物技术有限公司提供，转染用Lipofectamine 2000TM购自美国Thermofisher公司。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 提取组织总RNA将组织标本研磨成粉末，按照说明书使用Trizol Reagent提取总RNA，并用RNasey Mini Kit进行纯化。纯化后采用紫外分光光度计鉴定RNA的纯度，电泳检测RNA的完整性，于-80℃冰箱内保存。

1.2.2 qRT-PCR采用SYBR Green I嵌合荧光法进行miRNA检测，严格按照说明书进行操作：①取2μg含有目的miRNA的总RNA，使用miRcutemiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit在miRNA 3'末端加多聚Poly A尾，再使用Oligo（dT）-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终合成miRNA对应的cDNA第一链，反应条件：37℃预变性60 min，95℃变性5 min，60℃退火34 s，35℃延伸4 min。 ②取2μl miRNA第一链cDNA液，采用miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）进行miRNA荧光定量检测，PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性20 s，60℃退火34 s，35℃延伸4 min，共45个循环。以U6为内参，检测miR-145-3p的相对表达量。

1.2.3 细胞培养及转染SH-SY5Y用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基于37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养，每2～3天更换1次培养基，待细胞融合度达80%～90%时进行传代培养。细胞转染前1天，使用6孔板接种SH-SY5Y细胞，待细胞密度达70%～80%，使用Lipofectamine 2000TM进行细胞转染，严格按照试剂盒说明书进行操作。实验分miR-145-3p组和阴性对照组，阴性对照组选用miRNA模拟物（无义miRNA），miR-145-3p组选用miR-145-3p mimics。转染后6 h去除培养基，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2正常培养用于后续实验。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖取转染后的SHSY5Y细胞，0.25%胰酶消化细胞后进行离心，将细胞按5×103个/孔接种于96孔板，作用不同时间（0、24、48、72及96 h）后每孔加入CCK-8 10μl，2 h后使用酶标仪记录450 nm各孔光密度（OD）值，绘制生长曲线。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移取转染后细胞，胰酶消化后进行离心，无血清培养基进行细胞悬浮、计数，将细胞按1×104个/孔种植于专用于细胞迁移实验的24孔板上，上层小室使用2% FBS完全培养基100μl， 下层小室加入600μl含10% FBS的培养基，37℃、5% CO2孵育72 h，取出小室，吸弃上室培养液，用棉签擦去上层细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫染色30 min，清水冲洗后进行细胞计数。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验为寻找miR-145-3p的靶点，采用miRBase及Targetscan预测发现GDNF基因的3’-UTR存在miR-145-3p的潜在结合位点。构建野生型（与miR-145-3p完全互补）及突变型（与miR-145-3p不完全互补）GDNF质粒（见图1），与miR-145-3p模拟物共转染细胞。取对数生长期细胞，接种至96孔培养板，在细胞生长密度至80%时进行转染，48 h吸去培养液，加入裂解液裂解15 min，12 000 r/min离心15 min，将5μl裂解产物加入100μl反应底物中，检测荧光酶活性。取出后再加入l00μl Stop&Glo® Reagent，迅速放入检测仪内读取数值，根据Firefly/Renilla比值计算相对表达量。

图1 构建的突变型及野生型GDNF质粒示意图

1.2.7 Western blotting细胞转染后加入蛋白质抽提试剂，细胞裂解后冰上吹打15 min，收集细胞液加入EP管中，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清分装后于-80℃冰箱内保存。采用BCA法进行蛋白定量，取等量蛋白加入5×蛋白上样缓冲液，加入上样孔后进行电泳，110 V恒定电压下电泳至溴酚蓝刚出胶底部。48 V电转50 min将蛋白转移至PVDF膜上，TBS漂洗后加入封闭液振荡4 h，封闭后加入稀释好的一抗，4℃过夜，TBS漂洗后加入HRP标记的二抗，加入电化学发光液、显影及定影，并用Image J软件将图片上每个特异条带的灰度数字化。

1.2.8 免疫组织化学染色取等量组织标本在60℃下烤片2 h，常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗，采用微波修复法行抗原修复。过氧化氢及山羊抗血清封闭，加入1∶1 000 GDNF一抗4℃孵育过夜，阴性对照采用0.1 mmol/L PBS替代一抗，PBS冲洗后加入二抗，37℃孵育1 h。PBS冲洗3次，DAB显色10 min，加入苏木精复染，二甲苯透明，封片后于显微镜下观察 摄片。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0及GraphPad Prism5.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验、重复测量设计的方差分析或秩和检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.O5为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HD病变肠管组与正常肠管组miR-145-3p mRNA的表达

HD病变肠管组和正常肠管组miR-145-3p mRNA相对表达量分别为（6.506±3.179）和（0.925±0.665），经t检验，差异有统计学意义（t=10.680，P=0.000）；HD病变肠管组高于正常肠管组。见图2。

图2 HD病变肠管组与正常肠管组miR-145-3p mRNA相对表达量比较 （±s）

2.2 转染miR-145-3p模拟物对细胞增殖及迁移能力的影响

miR-145-3p组与阴性对照组miR-145-3p相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-145-3p组高于阴性对照组。见表2和图3。

表2 两组miR-145-3p相对表达量比较 （±s）

表2 两组miR-145-3p相对表达量比较 （±s）

组别 miR-145-3p miR-145-3p组 101.200±11.610阴性对照组 1.000±0.016 t值 -2.611 P值 0.008

图3 miR-145-3p组与阴性对照组miR-145-3p 相对表达量比较 （±s）

miR-145-3p组与阴性对照组转染后0、24、48、72及96 h OD值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点OD值比较，差异有统计学意义（F=53.290，P=0.000）；②两组OD值比较，差异有统计学意义（F=23.710，P=0.000），miR-145-3p组较阴性对照组低，细胞增殖能力下降；③两组OD值变化趋势比较，差异有统计学意义（F=4.078，P=0.014）。两组迁移细胞数比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-145-3p组迁移到下室的细胞数减少，细胞迁移能力降低。见表3、4和图4～6。

2.3 miR-145-3p与靶基因GDNF的作用关系

野生型GDNF与突变型GDNF转染细胞miR-145-3p相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），野生型GDNF质粒可降低细胞miR-145-3p的表达。见表5和图7。

2.4 miR-145-3p下调细胞GDNF的表达

miR-145-3p组和阴性对照组蛋白相对表达量分别为（0.292±0.037）和（0.466±0.035），经t检验，差异有统计学意义（t=7.876，P=0.016）。上调miR-145-3p表达后，细胞GDNF蛋白表达降低。见图8。

表3 两组不同时间点OD值比较 （±s）

表3 两组不同时间点OD值比较 （±s）

组别 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h miR-145-3p组 0.283±0.023 0.325±0.035 0.382±0.048 0.432±0.038 0.482±0.042阴性对照组 0.281±0.018 0.346±0.028 0.442±0.038 0.532±0.042 0.632±0.049

表4 两组迁移细胞数比较 （个，±s）

表4 两组迁移细胞数比较 （个，±s）

组别 迁移细胞数miR-145-3p组 16.00±2.280阴性对照组 48.20±6.344 t值 4.722 P值 0.009

图4 转染后对SH-SY5Y细胞迁移的影响 （结晶紫染色×40）

图5 两组OD值变化趋势 （±s）

2.5 GDNF在HD病变段肠管中低表达

免疫组织化学法结果显示，HD病变段肠管中仅有5例GDNF呈弱阳性表达（12.5%），另外35例患者为阴性（87.5%）；而40例正常肠管GDNF表达均呈强阳性（100.0%）。两组GDNF蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=80.000，P=0.000）。见图9。

图6 两组迁移细胞数比较 （±s）

表5 两组野生型及突变型GDNF质粒转染后细胞miR-145-3p mRNA相对表达量比较 （±s）

表5 两组野生型及突变型GDNF质粒转染后细胞miR-145-3p mRNA相对表达量比较 （±s）

组别 野生型GDNF质粒突变型GDNF 质粒 t值 P值miR-145-3p组 1.000±0.023 0.402±0.073 11.600 0.000阴性对照组 1.023±0.084 1.008±0.029 0.797 10.826

图7 两组野生型及突变型GDNF质粒转染后细胞 miR-145-3p mRNA相对表达量比较 （±s）

图9 HD病变肠管及正常肠管中GDNF的表达 （免疫组织化学染色×100）

3 讨论

由于某些因素作用，使肠神经母细胞增殖、迁移及分化能力受到影响，最终细胞不能达到终点，使得远端肠管的神经节细胞缺如，导致HD形成[9]。miRNA是非编码RNA中的一种，长度为21～23nt，其在生命的多个环节中起重要作用[10-11]。多个miRNA被证实与HD的发生、发展关系密切，如miR-483-5p[4]、Let-7a[12]、miR-215[5-6]、miR-206[7]、miR-1324[13]及miR-192[6]等。前期研究采用miRNA微阵列基因芯片及qRT-PCR检测发现，miR-145-3p在HD病变段肠管中存在高频高表达[8]，但其作用及具体机制并不清楚。

miR-145-3p是一种功能强大的miRNA，其作为一个调控基因，参与细胞增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物过程的调控。MISONO等[14]报道，miR-145-3p在肺腺癌中低表达，过表达miR-145-3p可以抑制肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，其在肺腺癌中起着抑癌基因的作用。YAMADA等[15]报道，miR-145-3p在头颈部鳞状细胞癌中低表达，过表达miR-145-3p后细胞的增殖、迁移及侵袭能力均受到抑制。MATSUSHITA等[16]证实，miR-145-3p在膀胱癌中低表达，miR-145-3p可以抑制细胞增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡，发挥抑癌基因作用。本研究结果同样证实，上调miR-145-3p可以抑制神经母细胞的增殖及迁移，影响肠神经系统发育，在HD形成过程中发挥作用。

miRNA的作用机制有很多种，与靶基因的3＇-UTR结合进而调控细胞表达是其主要的作用方式。在不同的细胞中，miR-145-3p可与不同的靶基因结合而发挥截然不同的作用，其在HD中的作用机制不明。GDNF是神经腔质细胞衍化亲神经营养因子，是重要的肠神经元及神经节细胞的营养生存因子，其与Ret基因及GDNF-α形成多聚体受体复合物[2]。GDNF不仅起到传递Ret基因发挥作用的信号作用，并且有协助Ret基因促进神经节细胞移行、分化及定位功能[9]。如果GDNF蛋白表达异常，就会影响神经母细胞发育，产生HD。在体内剔除鼠GDNF基因，可以导致小鼠全结肠缺乏神经节细胞，形成HD[17]。笔者通过利用miRBase、TargetScan检索miR-145-3p的碱基序列并预测其靶基因，结果提示GDNF是其可能的靶基因。随后采用双荧光素酶报告基因实验证实，miR-145-3p的确可以与GDNF的3＇-UTR结合影响GDNF的表达。Western blotting检测证实，过表达miR-145-3p可以下调细胞GDNF蛋白表达，初步确认GDNF是miR-145-3p的重要分子靶标。而在组织标本中，笔者发现GDNF在HD中低表达，与miR-145-3p高表达呈负相关，进一步证实在HD形成过程中miR-145-3p发挥的作用与调控GDNF的表达有关。

综上所述，miR-145-3p与HD发病关系密切，其可以通过调控GDNF的表达影响神经母细胞的增殖及迁移，参与HD形成。本研究为HD的诊疗提供一个新的重要靶点，miR-145-3p对肠神经干细胞及动物模型的影响仍有待进一步实验证实。