谢娜，吕兴华，于澄，高翠敏，马玉清

（兰州大学第一医院，麻醉科 甘肃 兰州 730000）

脓毒症是重症医学科常见的危重症之一，严重脓毒症患者常并发多器官损伤。肺脏往往是脓毒症时最易受损的靶器官，在病程早期便可出现急性肺损伤（acute lung injury, ALI），引起呼吸系统功能障碍，这是导致脓毒症患者死亡的首要病因[1-2]。近年来研究发现，高迁移率族蛋白B1（high modility group box 1, HMGB1）是一种高度保守的核蛋白，其作为晚期炎症因子在脓毒症中发挥重要作用[3]。丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate, EP）是一种有效的HMGB1抑制剂，具有抗炎和免疫调节效应[4]。有研究表明，EP能降低致死性脓毒症大鼠的病死率且有效改善急性胰腺炎、病毒性心肌炎等疾病的临床症状，具有一定的器官保护作 用[5-6]。但EP对脓毒症ALI是否有保护作用及其可能机制尚未明确。本实验采用盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型，探讨EP对脓毒症ALI的保护作用，并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

清洁级健康成年雄性SD大鼠40只，6～8周龄，体重200～240 g，由兰州大学医学院动物实验中心提供。EP（美国Sigma公司，批号：E47808），高效RIPA裂解液（北京索莱宝生物科技有限公司，货号：R0010），HMGB1、Toll样受体4（TLR4）、核转录因子κB（NF-κB）、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.2 模型的复制

将40只SD大鼠采用随机数字表法分为对照组、假手术组、ALI组和EP组，每组10只。ALI组和EP组采用盲肠结扎穿孔法复制脓毒症模型[7]：大鼠称重后，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后固定，沿腹正中线做1.5 cm长切口暴露盲肠，在回盲瓣与盲肠末端的正中间结扎，用18 G针头在盲肠结扎端对穿2次，形成盲肠漏，再将盲肠还纳回腹腔，逐层缝合腹壁切口。假手术组仅翻动盲肠，不做结扎穿孔。EP组在术后6、12及18 h腹腔注射40 mg/kg EP，对照组、假手术组和ALI组在以上相同时间点腹腔注射等量乳酸林格液。EP溶液的配制方法：EP溶解到乳酸林格液中，配置成3.26 g/L的溶液，4℃冰箱保存 备用。

1.3 标本采集与观察指标

1.3.1 标本收集模型复制24 h后心脏采血处死大鼠，沿胸骨正中线剪开胸骨，暴露肺脏，取出肺脏用无菌冷PBS漂洗表面的血液，收集肺组织标本。

1.3.2 HMGB1、TLR4及NF-κB水平剪取适量左肺组织称重后，按1 g组织加入9 ml PBS的比例配置，再按照每20 mg肺组织加入150～200μl RIPA裂解液的比例配置，在冰上用匀浆器制备成10%肺组织匀浆，4℃、4 000 r/min离心20 min，吸取上清液， -80℃保存。ELISA试剂盒检测肺组织匀浆中HMGB1、TLR4及NF-κB水平。

1.3.3 肺组织湿干重比取右上肺叶，用滤纸吸干肺组织表面的血液，用天平称出的重量为湿重；将肺组织放入80℃烤箱干烤48 h后取出，称出的重量为干重，计算肺组织湿干重比。

1.3.4 肺组织病理结构观察取右中肺叶，置于10%甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片和HE染色，光镜下观察肺组织病理结构变化。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步的两两比较用SNK-q法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平 比较

各组大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水 平 比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。ALI组、EP组较假手术组高（P＜0.05），EP组较ALI组低（P＜0.05）；对照组与假手术组HMGB1、TLR4及NF-κB水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠肺组织湿干重比

对照组、假手术组、ALI组及EP组大鼠肺组织 湿干重比分别为（4.67±0.15）、（4.79±0.13）、（5.40±0.16）和（5.08±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=32.269，P=0.000）。ALI组、EP组较假手术组高（P＜0.05），EP组较ALI组低（P＜0.05）；对照组与假手术组肺组织湿干重比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平比较 （n =10，ng/ml，±s）

表1 各组大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平比较 （n =10，ng/ml，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与ALI组比较，P ＜0.05。

组别 HMGB1 TLR4 NF-κB对照组 66.96±3.75 13.87±1.44 0.89±0.07假手术组 70.30±4.29 14.96±1.39 0.92±0.08 ALI组 118.33±5.58① 50.20±2.64① 1.49±0.13①EP组 96.41±4.14①② 25.56±2.72①② 1.30±0.05①②F值 313.048 680.933 140.251 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 大鼠肺组织病理结构变化

对照组和假手术组肺组织结构完整，肺泡间隔无水肿、炎症；ALI组肺泡结构破坏严重，肺泡间隔增宽，肺间质渗出、出血和大量炎症细胞浸润；EP组肺泡结构较完整，与ALI组相比，肺间质渗出、出血及炎症细胞浸润症状减轻。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理切片 （HE染色）

3 讨论

本研究参照RITTIRSCH等[7]研究方法采用盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型。结果表明，ALI组大鼠24 h处死后，打开腹腔有臭味和血性腹水，腹腔内脏器粘连严重，肠道充气扩张，盲肠结扎段发黑，甚至坏死；肺组织病理学显示肺泡结构严重破坏，肺间隔增宽，肺间质渗出、出血和大量炎症细胞浸润，提示大鼠脓毒症ALI模型复制成功。

HMGB1被证实是导致脓毒症死亡的关键细胞因子，其在体内的合成释放明显延迟且持续时间长，对脓毒症发展与预后均有重要影响[8]。TLR4是HMGB1重要的胞膜受体，在脓毒症的炎症反应激活、免疫调节等过程中发挥重要作用[9]。脓毒症时，早期炎症介质和内毒素刺激单核/巨噬细胞，以及坏死、损伤细胞会主动或被动分泌HMGB1，释放到细胞外的HMGB1与其内源性配体TLR4结合，激活MyD88依赖性途径使NF-κB活化，诱导下游炎症介质大量释放，使内皮细胞受损，直接或间接损伤肺的结构和功能[10-13]。本研究ALI组大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平升高，同时肺组织病理切片显示肺泡结构严重破坏，肺间质渗出、出血，大量炎症细胞浸润；肺组织肺组织湿干重比增加，肺水肿加重。以上结果表明，肺组织中HMGB1、TLR4及NF-κB水平与肺组织结构的损伤、肺功能障碍相关并呈依赖性，提示脓毒症所致ALI与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活密切相关。

EP是一种稳定性高、亲脂性强的丙酮酸脂化物，作为丙酮酸的替代物广泛应用于动物实验。不同的动物实验模型证实，EP可以通过抑制HMGB1/TLR4信号通路的激活，抑制促炎因子的释放，从而减轻肠道炎症反应、肝损伤和心肌缺血再灌注损伤，保护脏器功能[14-16]。但EP作为一种有效的HMGB1抑制剂，是否通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路来发挥对脓毒症ALI的保护作用，目前尚未完全明确。本研究观察到，给予EP进行干预后，大鼠肺组织匀浆中HMGB1、TLR4及NF-κB水平较ALI组降低，说明HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路被抑制，同时肺组织结构和功能障碍改善，表明EP可以缓解脓毒症ALI，推测其作用机制可能是通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路，减少炎症因子释放，减轻肺组织炎症反应，从而对脓毒症ALI产生保护作用。

综上所述，脓毒症所致ALI与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路密不可分，EP干预后，可减轻肺组织结构和功能损伤，其作用机制可能是通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路，减少炎症因子释放，减轻肺组织炎症反应，从而对脓毒症ALI起保护作用，可为临床治疗脓毒症ALI提供理论依据。