李小玲,刘 荣,华智锐

(商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000)

干旱是常见的非生物胁迫因子之一,严重影响植物的产量和质量。根据相关报道,每年因干旱造成的全球农作物产量损失率达50%以上,而全球气候变暖又加剧了干旱对农作物的破坏。植物的抗旱性除受多基因控制外还受到其它环境因子的影响,其机理较为复杂,目前,还缺乏有效的提高作物抗旱性的方法。因此,干旱对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位。

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)属于唇形科黄芩属多年生草本植物,以根入药,具有清热降火、凉血安胎、解毒等多种功效,是我国常用大宗中药材之一[1]。近年来,中药产业的发展带动了黄芩的规范化栽培及市场需求量。但由于全球气候变暖,高温少雨、大气水分及土壤水分缺乏使土地失墒问题愈发突出,导致黄芩种子吸水能力显著下降,严重影响了黄芩的产量及质量。如何提高干旱条件下植物的产量,是科研工作者长期以来急需解决的问题。研究发现,在干旱胁迫下植物会产生大量的活性氧和自由基,破坏植物体内的生物大分子,引起细胞膜脂质过氧化作用及导致细胞结构的损伤。因此,寻找一种化控措施来提高黄芩在干旱地区生产中的抗旱性至关重要,对于扩大黄芩人工栽培具有重要的意义。

壳聚糖(CTS)又称为脱乙酰甲壳素,学名聚氨基葡萄糖,它是由甲壳素经脱乙酰化作用得到的直链状高分子化合物[2]。甲壳素是许多低等动植物(虾、蟹、昆虫、真菌、藻类等)的重要组成成分,天然无害、环保、可生物降解，不仅具有良好的生物相容性[3],而且具有良好的成膜性、附着性和吸湿性[4],可以被广泛应用于工业、农业、生物等领域。研究表明,抽穗期玉米花丝和穗轴经CTS处理能有效提高种子的贮藏蛋白和醇溶蛋白含量,可作为一种新型蛋白质生物调节剂应用于农业生产中[5]。CTS及其寡糖都属于天然产物,对植物无任何毒副作用。众多研究表明,CTS可作为一种新型的植物生长调节剂,促进植物生长,增强植物的抗逆能力[6-9],在农业生产方面具有广阔的应用前景。

近年来,前人针对黄芩的种质资源、化学成分、质量以及药理作用等方面开展了大量研究[10],但目前有关壳聚糖对黄芩种子萌发及幼苗抗旱性的影响研究尚未见报道。前人已开展壳聚糖对玉米[9]、小麦[11]、苹果[12]等植物抗旱性的影响研究,而在药用植物中的相关研究报道较少。因此,本试验以商洛黄芩为材料,研究了外源壳聚糖对黄芩种子萌发及干旱胁迫下的幼苗生理特征的影响,旨在探索CTS对黄芩种子萌发及幼苗抗旱性的影响,为将CTS作为抗旱剂应用到黄芩抗旱栽培中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用黄芩种子及幼苗于2018年4月中旬购自洛南药材种植基地,为一年生黄芩幼苗;CTS购自陕西博诺生物技术有限公司,含量≥99.5%,分析纯试剂AR级。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 选取成熟饱满、大小一致的黄芩种子,用1.0%的次氯酸钠消毒5 min,然后用蒸馏水冲洗并自然晾干,备用;将所购买的黄芩幼苗移栽至直径约15 cm的花盆中,进行预培养,在户外温度下培养1个月左右,在此期间,定时浇水和松土以保持土壤湿润。

1.2.2 黄芩种子的处理 先用少量2% HAC溶解CTS,再加蒸馏水配制成不同浓度(体积分数)的CTS溶液。本试验设1个对照和5个处理: CK，蒸馏水对照；处理T1，0.05% CTS; T2,0.10% CTS; T3,0.15% CTS; T4,0.20% CTS; T5.0.25% CTS。

将预处理的黄芩种子分别用不同浓度的CTS溶液浸种24 h,然后取出晾干；以等量蒸馏水浸种为对照(CK)。采用纸上发芽床法,在洗净、烘干的培养皿(直径9 cm)中铺单层滤纸,并加入蒸馏水,整齐地放入50粒黄芩种子,置入人工气候箱中培养,培养温度设为25 ℃/16 ℃(昼/夜)，相对湿度为75%,光照强度为1400 lx。每个处理重复3次,每天记录发芽的种子数；定期补充蒸馏水,在第6天统计发芽势,在第10天统计发芽率、发芽指数。

1.2.3 黄芩幼苗的处理 试验设2个对照和5个处理: CK1,蒸馏水对照; CK2,20% PEG6000，药剂对照;处理T1,0.05% CTS+20% PEG6000; T2,0.10% CTS+20% PEG6000; T3,0.15% CTS+20% PEG6000; T4,0.20% CTS+20% PEG6000; T5,0.25% CTS+20% PEG6000。

将CK2、T1～T5中的黄芩幼苗用20% PEG6000[13,14]模拟干旱处理24 h后,用喷雾器将不同浓度的CTS喷于相应处理的黄芩幼苗叶片正反面,每天喷洒1次,共处理5 d,其中CK1、CK2施加蒸馏水。在间隔4 d后选取长势良好的植株，测定黄芩幼苗叶片的叶绿素含量、保护酶(POD、SOD、CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量等生理指标,以筛选适宜的CTS浓度。

1.2.4 生理指标的测定 发芽势、发芽率、发芽指数的统计参照《国际种子检验规程》[15];叶绿素含量的测定参照张志良等[16]的分光光度法;SOD活性的测定参照李合生等[17]的氮蓝四唑(NBT)光还原法;POD活性的测定参照李合生等[17]的愈创木酚法;CAT活性的测定参照李合生等[17]的紫外分光光度法;MDA含量的测定参照张志良等[16]的硫代巴比妥酸法;脯氨酸含量的测定参照李合生等[17]的茚三酮法;可溶性糖含量的测定参照李合生等[17]的苯酚法。

1.3 数据分析

所有试验数据为3次重复测定值的平均值,用Excel 2010进行数据统计,用SPSS 22.0进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度壳聚糖对黄芩种子发芽势的影响

由图1可以看出：不同浓度的壳聚糖溶液浸种处理24 h后,黄芩种子的发芽势与对照组CK相比差异显著(P<0.05),并且在一定范围内出现浓度效应,即随着浓度的增加,发芽势也逐渐增加,当壳聚糖浓度增加至0.15%时,发芽势达到最大,且比对照组高出22.6个百分点；之后随着壳聚糖浓度上升,其对黄芩种子萌发的促进作用逐渐下降。可见,适宜浓度的壳聚糖溶液能显著地提高黄芩种子的发芽势。

标有不同字母的处理间在0.05水平下差异显著。下同。图1 不同浓度壳聚糖对黄芩种子发芽势的影响

2.2 不同浓度壳聚糖对黄芩种子发芽率的影响

由图2可见：经不同浓度的壳聚糖溶液浸种处理24 h后,黄芩种子的发芽率与对照组CK相比差异显著(P<0.05),且在一定范围内呈现浓度效应,即随着浓度的增加,发芽率逐渐增加；当壳聚糖溶液浓度增加至0.15%时,发芽率达到最大,且比对照组高出24.1个百分点；之后随着壳聚糖浓度的上升,其对黄芩种子发芽的促进作用逐渐下降,但仍高于对照组CK的。可见,适宜浓度的壳聚糖溶液能显著地提高黄芩种子的发芽率。

2.3 不同浓度壳聚糖对黄芩种子发芽指数的影响

由图3可以看出：用不同浓度的壳聚糖溶液浸种处理黄芩种子24 h后,发芽指数呈上升的趋势,与对照组CK差异显著(P<0.05),且在一定浓度范围内呈现递增递减趋势；当壳聚糖溶液浓度上升至0.15%时,发芽指数达到最高峰,且比对照组CK高出61.3%；之后随着壳聚糖浓度的上升,其对黄芩种子发芽的促进作用逐渐下降,但仍高于对照组CK。可见,适宜浓度的壳聚糖溶液能显著提高黄芩种子的发芽指数。

图2 不同浓度壳聚糖对黄芩种子发芽率的影响

图3 不同浓度壳聚糖对黄芩种子发芽指数的影响

2.4 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗叶片叶绿素含量的影响

从图4中可以看出：对照组CK2与CK1相比,黄芩幼苗叶片叶绿素含量明显下降18.8%,说明干旱胁迫显然抑制了黄芩幼苗叶片中的叶绿素含量；在喷施不同浓度的壳聚糖溶液后,叶绿素含量趋于上升,与对照组CK1、CK2相比,差异显著,且在一定范围内存在浓度效应；当壳聚糖浓度为0.15%时,黄芩幼苗叶片中叶绿素含量最高,为2.75 mg/g,且比对照组CK1、CK2分别高出78.6%和120.0%,且差异显著(P<0.05)；之后随着壳聚糖浓度的上升,其对黄芩幼苗叶绿素合成的促进作用逐渐下降,但仍高于对照组。结果表明,喷施0.15%的壳聚糖对促进光合色素含量的升高有显著作用,且能有效缓解干旱胁迫对黄芩幼苗光合色素的抑制效应。

2.5 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗SOD活性的影响

由图5可知：与CK1相比，对照组CK2的黄芩幼苗SOD活性明显上升,说明干旱胁迫可促进黄芩植株体内SOD活性的增加；当喷洒壳聚糖溶液后,黄芩幼苗的SOD活性也不断增强,且在一定浓度范围内存在浓度效应,当壳聚糖溶液浓度为0.15%时,SOD活性最大,为158.69 U/(g·min),且比对照组CK1、CK2分别高出40.7%和19.8%,差异达到了显著水平(P<0.05)；之后随着壳聚糖浓度的上升,其对SOD活性的促进作用逐渐下降,但仍高于对照组。结果表明,喷施0.15%的壳聚糖溶液可明显提高黄芩幼苗中SOD活性,且有效缓解干旱胁迫对黄芩幼苗的伤害。

图4 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗叶片叶绿素含量的影响

图5 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗SOD活性的影响

2.6 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗POD活性的影响

由图6可以看出：CK2与CK1相比,黄芩幼苗POD活性显著上升25.1%；当壳聚糖浓度达到0.15%时,黄芩幼苗POD活性达到最高峰,为23.58 U/(g·min)，且比对照组CK1、CK2分别高出86.0%、48.7%，存在显著性差异(P<0.05);当壳聚糖浓度大于0.15%时,黄芩幼苗POD活性逐渐下降,但仍高于对照组。结果表明,适宜浓度的壳聚糖处理能提高黄芩幼苗的POD活性,增强其在干旱胁迫下的代谢强度，且有效地缓解干旱胁迫对黄芩幼苗的伤害。

2.7 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗CAT活性的影响

由图7可知：CK2与CK1相比,CAT活性显著上升11.5%,表明逆境胁迫下黄芩植株体内保护酶活性明显上升；当喷洒壳聚糖溶液后,CAT活性在一定范围内存在递增递减趋势；当壳聚糖溶液浓度为0.15%时,CAT活性最高,为4.97 U/(g·min),与对照组CK1、CK2相比分别高出42.8%、28.1%,差异达显著水平(P<0.05)；之后随着壳聚糖浓度的上升,CAT活性显著减弱,但仍高于对照组。由此表明,喷施0.15%的壳聚糖溶液可明显提高黄芩幼苗中CAT活性,且有效缓解干旱胁迫对黄芩幼苗的伤害。

图6 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗POD活性的影响

图7 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗CAT活性的影响

2.8 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗MDA含量的影响

由图8可知：CK2与CK1相比,黄芩幼苗叶片MDA含量显著增加,表明干旱胁迫导致膜脂过氧化作用增强；当喷洒壳聚糖溶液后，MDA含量呈现先减后增的趋势,在T3处理下达到最低谷值6.92 nmol/g,分别比对照组CK1、CK2降低了39.6%、47.2%,存在显著差异(P<0.05)，且其它处理的MDA含量较对照CK2均有不同程度的降低,这说明喷施壳聚糖溶液能显著抑制MDA的生成；之后随着壳聚糖溶液浓度的上升,MDA含量明显增加,且仍低于对照。可见,当壳聚糖溶液浓度为0.15%时,黄芩幼苗受到干旱胁迫危害最小,抗旱性最强。

图8 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗MDA含量的影响

2.9 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗脯氨酸含量的影响

由图9可看出：CK2黄芩幼苗的脯氨酸含量较CK1显著上升17.3%,说明黄芩幼苗在逆境情况下,体内脯氨酸含量明显上升；当喷洒壳聚糖溶液后,脯氨酸含量也持续上升,且在一定浓度范围内存在递增递减趋势；当壳聚糖溶液浓度为0.15%时,脯氨酸含量达到最高峰,为10.75 μg/g,且比对照组CK1、CK2分别高出194.5%、151.1%,有显著性差异(P<0.05)；随着壳聚糖溶液浓度的增加,其对黄芩幼苗脯氨酸含量的促进作用逐渐下降,但仍高于对照组。结果表明,当CTS浓度为0.15%时,黄芩幼苗受到干旱胁迫危害最小,抗旱性最强。

图9 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗脯氨酸含量的影响

2.10 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗可溶性糖含量的影响

由图10可知：在20% PEG6000模拟干旱胁迫下黄芩幼苗叶片可溶性糖含量随着壳聚糖浓度的增加呈现先升后降的趋势；对照组CK2的黄芩幼苗可溶性糖含量较CK1明显提高1.92个百分点；当壳聚糖浓度为0.15%时,可溶性糖含量达到最高,为9.56%,且比对照组CK1、CK2分别高出5.14、3.22个百分点,差异达显著性水平(P<0.05)；随着壳聚糖溶液浓度的进一步上升,其对黄芩幼苗可溶性糖含量的促进逐渐下降,但仍高于对照组。结果表明,当壳聚糖浓度为0.15%时,渗透调节物质可溶性糖含量最高,可降低植物组织水势,提高植物的吸水能力,从而显著提高黄芩幼苗的抗旱性。

图10 不同浓度壳聚糖对干旱胁迫下黄芩幼苗可溶性糖含量的影响

3 讨论

种子的发芽率(势)及发芽指数代表着种子的活力指标,是衡量种子质量的重要指标。在本试验中,用不同浓度的壳聚糖溶液浸种处理黄芩种子,其各项萌发指标都以在0.15% CTS处理下最佳；而当CTS浓度高于0.15%时,其萌发指标逐渐下降。说明壳聚糖能够明显提高种子发芽的呼吸速率,并随着壳聚糖浓度的增大而提高,使种子内的物质加速转化,进而促进种子的萌发。而随着壳聚糖浓度的不断增加,种子的呼吸速率过快,促使大量的能量以热量的形式散失,降低了壳聚糖的促进作用。

叶绿素是植物光合作用中非常重要的色素,其含量的高低决定了植物光合能力的强弱。在本试验中,用20% PEG6000模拟干旱处理黄芩幼苗,导致其叶绿素含量明显下降,这说明干旱胁迫会对植物光合器官造成伤害。当喷洒壳聚糖溶液后,叶绿素含量得到显著提高,且浓度为0.15%时效果最佳,表明壳聚糖可抑制逆境胁迫对植物的伤害,提高黄芩幼苗叶绿素含量,进而促进其光合能力,促进干物质和能量的积累,有利于后期黄芩幼苗的生长发育。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物组织中重要的保护酶,与植物的衰老和抗逆性密切相关。当植物受到逆境胁迫时,体内产生大量活性氧自由基,而保护酶SOD可以催化超氧物阴离子自由基,生成O2和H2O2。为了避免H2O2对细胞的氧化损伤,通过CAT将生成的H2O2分解为O2和H2O。本研究发现，在干旱胁迫下黄芩幼苗保护酶活性显著高于对照组,这与段辉国等[18]、郭东会等[19]、张俊风等[20]的研究结果一致。在本试验中,用壳聚糖溶液处理干旱胁迫下黄芩幼苗后,其保护酶活性都得到明显提高,且在壳聚糖溶液浓度为0.15%时效果最佳。表明壳聚糖可抑制逆境胁迫对植物的伤害,延缓黄芩的衰老,增强其抗逆性,促进黄芩幼苗的生长发育。

当植物遭受逆境胁迫时,其细胞中活性氧自由基的产生和清除之间的平衡遭到破坏,自由基迅速积累,造成膜脂过氧化,产生大量的丙二醛(MDA)。因此,MDA含量能反映黄芩幼苗叶片生物膜受伤害的程度及其抗旱性的强弱。在干旱胁迫下,黄芩幼苗叶片中的MDA含量得到明显的提升,而经过壳聚糖溶液处理后,MDA含量显著降低，均低于对照组,且以0.15%浓度的效果最佳,说明壳聚糖可缓解膜脂过氧化的过程,降低丙二醛的含量。

脯氨酸和可溶性糖是植物细胞中重要的渗透调节物质,与植物抗逆性密切相关。脯氨酸能够有效保持细胞质基质与环境的渗透平衡,预防水分丢失,并能保护膜结构的完整性。可溶性糖通过调节植物组织渗透势,在逆境下维持植物生长。在本试验中,用壳聚糖处理干旱胁迫下的黄芩幼苗,其脯氨酸、可溶性糖的含量均高于对照组,且以0.15%浓度时效果最佳。这与顾丽嫱等[21]、从心黎等[22]的研究结果基本一致。说明干旱情况下施加壳聚糖可有效地提高脯氨酸、可溶性糖含量,降低对幼苗的干旱胁迫。

综上所述，适宜浓度(0.15%)的壳聚糖处理可抑制黄芩幼苗MDA含量的增加,提高种子的萌发率，增强植物细胞内保护酶活性，增加光合色素和渗透调节物质的含量，从而防止或降低膜脂过氧化作用对质膜的伤害。本试验结果可为黄芩的抗旱性研究提供参考,也可为利用壳聚糖作为化控措施来增强黄芩的耐旱性提供理论依据。本研究开展了外源CTS喷施最佳浓度试验,但主要针对盆栽苗开展研究,而对于黄芩大田栽培中相关生理生化指标的研究还有待进一步开展。