陈利云，呼丽萍，汪之波

(天水师范学院 生物工程与技术学院/甘肃省大樱桃工程技术研究中心，甘肃 天水 741000)

天然无污染微生物菌肥能提高作物的产量和品质，增强作物的抗逆性，是发展绿色可持续农业的重要途径。植物内生菌(endophytic fungi)是一类生活在活体植物组织内的微生物菌体，具有不同生存策略，与宿主共生的内生菌不会引发植物产生明显病害症状[1]。1993年Stierle从短叶红豆杉(TaxusbrevifoliaNutt)内生菌中分离出抗癌药物紫杉醇，推动了从植物内生菌中寻求活性生物活性代谢物的研究[2]，在真菌、细菌和放线菌中，植物内生真菌是目前研究的热点[3-5]，它们代谢产生的酚类物质、抗氧化活性物质、生物碱等物质能促进宿主植物的生长并增强植物抗逆性[6-7]。银杏(GinkgobilobaL.)是被称为“活化石”的裸子植物，在地球上已有约3亿年的演化历史，是银杏属唯一的现存种，也是我国特有的世界珍稀树种，内共生理论学说认为，在长期的进化历程中，银杏几乎不被病虫害感染的原因与其体内协同进化的多样性内生菌密不可分，而这些内生菌代谢产生高活性的抑菌物质，为此树种成为自然进化史中的活化石提供了保障[8-10]。本研究前期试验从银杏叶片中分离筛选了大量内生真菌，用这些内生真菌醇提取物处理凤尾鸡冠花，以探究不同的内生菌醇提取物对凤尾鸡冠花生长发育及抗逆性的影响，为深入解析内生真菌与宿主植物间的共生关系的分子机理，研制无污染、绿色、环保的生物制剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试凤尾鸡冠花：凤尾鸡冠花(CwlosiaargenteaL. cv.plumosa)，购买于北京金地永丰农业科技有限公司。供试内生真菌分离于天水地区本土银杏鲜叶(保存于天水师范学院农业微生物重点实验室)。

内生菌醇提取物：编号为Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ的内生菌醇提取物分别提取于编号为1、3、6的银杏内生真菌，分属于晶粒鬼伞种(Coprinusmicaceus)、链格孢属(Alternariasp.)、链格孢种(Alternariaalternate)，提取方法是在参考Wu等[11]方法的基础上做了优化。

1.2 试验设计

种子处理：供试的凤尾鸡冠花种子用10%的巴氏消毒液处理15～20 min，再用单蒸水清洗4～5次，分别用1 ng/mL内生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ浸泡12 h，设置超纯水浸种为对照，之后将种子移入MS培养液中发芽培养7～10 d，备用。

盆栽试验：培养盆(直径28 cm、高30 cm)装入同等质量的基质(沙、草炭、有机肥体积比为4∶1∶2)，种植以上处理过的种子，每处理3次重复，分甲乙2组温室培养，甲组植株长出2片子叶后(10 d)每5 d用100 mL 0.1 ng/mL的内生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ叶面喷洒处理组，培养30 d。

干旱试验：乙组植株长出2片子叶后(10 d)用浓度为0、30%的聚乙二醇(PEG-6000)溶液叶面喷洒做干旱胁迫处理，20 d后进行形态和生理指标的测定。

1.3 测定项目与方法

电子天平测定每盆植株鲜重，叶片面积用便携式叶面积测定仪进行测定，花色素的测定采用液质联用法分光光度法测定。抗病力检测采用西瓜壳二孢-甜瓜蔓枯病(AscochytaCitullinaSmith)病原真菌感染叶片，台盼蓝(Typan blue)染色程度的量化分析。叶绿素采用比色法测定，脯氨酸采用茚三酮显色比色法测定，丙二醛采用紫外分光光度法测定，可溶性糖采用蒽酮比色法测定。

1.4 数据处理

利用Excel 2007、SPSS 11软件对数据进行统计、整理、分析和作图。

2 结果与分析

2.1 内生菌醇提取物Ⅲ对凤尾鸡冠花生长发育的影响

内生菌醇提取物Ⅲ能促进凤尾鸡冠花地上植株的生长(图1)，与对照相比，植株茎秆明显粗壮，单株鲜重是对照的3.87倍，同时叶片面积明显增大，比未处理的对照增加了83%，呈显著差异。凤尾鸡冠花表型特性表明：内生菌醇提取物Ⅲ能促进鸡冠花茎、叶等器官变大，对凤尾鸡冠花的生长发育具有明显的促进作用。

2.2 内生菌醇提取物Ⅰ对凤尾鸡冠花耐旱性的影响

花青素含量是衡量植物耐旱能力的主要指标，对凤尾鸡冠花进行干旱胁迫培养显示，内生菌醇提取物Ⅰ处理的鸡冠花耐旱性明显提高(图2)。与对照相比植株成活率为增加了4.97倍。干旱胁迫比较敏感的植物花青素合成较快，未经内生菌醇提取物Ⅰ处理的凤尾鸡冠花花青素含量明显比处理过的高，为处理的2.7倍。

2.3 内生菌醇提取物Ⅵ凤尾鸡冠花抗病力的影响

内生菌醇提取物Ⅵ能增强抗病能力(图3)，将内生菌醇Ⅵ处理过的种子播种培养15 d后，叶片用西瓜壳二孢-甜瓜蔓枯病病原真菌感染，通过对台盼蓝染色程度的量化分析显示，与对照相比内生菌醇提取物Ⅵ处理过的鸡冠花死亡细胞数目显著降低，是对照的44%，试验结果表明，内生菌醇提取物Ⅵ能明显提高凤尾鸡冠花对蔓枯病病原菌的抵抗力。

A.内生菌醇Ⅰ处理干旱胁迫盆栽30 d的凤尾鸡冠花植株；B.未处理对照播种后30 d叶片上花青素。图2 内生菌醇Ⅰ对凤尾鸡冠花花青素含量的影响

A.用内生菌醇Ⅵ处理盆栽15 d后的凤尾鸡冠花植株；B.Ⅵ未处理的盆栽15 d植株。图3 内生菌醇Ⅵ对凤尾鸡冠花抗病力的影响

2.4 内生菌醇提取物对凤尾鸡冠花可溶性糖、叶绿素等物含量的影响

对由内生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ处理及对照培养30 d后的叶绿素、脯氨酸、丙二醛及葡萄糖含量检测显示，植株可溶性糖含量随着干旱胁迫程度的加强而增强(图4)，但其他几种活性物质含量与对照间无显著差异，内生菌醇提取物Ⅲ、Ⅵ对植株抗旱性无明显影响，而内生菌醇提取物Ⅰ能显著提高凤尾鸡冠花对干旱胁迫的抵抗力。

图4 内生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ对凤尾鸡冠花叶绿素、脯氨酸、丙二醛及葡萄糖含量的影响

3 讨论

共生在宿主组织中的内生真菌能促进宿主植物生长发育，它们能代谢产生生长素、赤霉素等植物激素，能加强宿主的生物固氮效率，增强宿主对矿物质营养元素如氮、磷、钾的吸收，从而促进宿主种子萌发率，提高幼苗存活、增加分蘖生长[12-15]。通过与宿主长期的协同进化，内生菌能产生与宿主植物相似或相同的活性化学物质，这些物质大多能促进植物生长发育并提高宿主植物对生物和非生物胁迫的抵抗力[16-17]。易婷等[18]研究发现，向日葵根部分离出的根瘤菌可通过分泌胞外多糖改变土壤结构增加植物根部对环境的适应性，从而促进向日葵的生长。内生菌醇提取物Ⅲ诱导凤尾鸡冠花叶片面积增大和生物量的增加很可能是通过活性物质改变根部土壤环境从而缓解了植物根部的非生物压力来实现的。

内生真菌在宿主细胞中的定殖、孢子萌发、菌体生长繁殖以及物质代谢过程都要受宿主植物表现型和基因型的影响，这种基因层面的交互作用产生的信息传导通路，使内生菌参与到宿主次生代谢产物合成的过程中，在其中起到协同或催化关键酶类合成的作用[19-20]，直接或间接地影响宿主植物的生长发育、抗逆性及生殖等过程，提高宿主植物在恶劣、贫瘠环境中的生存力[21]。内生菌醇Ⅵ处理能增强鸡冠花对西瓜壳二孢-甜瓜蔓枯病病原真菌侵染的抵抗力，降低叶片细胞死亡数目。内生菌醇提取物Ⅰ处理时凤尾鸡冠花可溶性糖含量随着干旱胁迫程度的增大而增加，这与Yu等[22]的研究结果一致，推测此种变化很可能是由内生菌醇提取物Ⅰ处理后，凤尾鸡冠花对糖信号感知能力发生变化引起的。

在植物体内，调控植物生长发育、胁迫、代谢等途径的信号通常是一致的，这都是生物进化的结果[23-24]。解析糖信号介导的内生菌提取物诱导鸡冠花高产抗逆性的分子机制，能为未来研发更高效的微生物肥料提供理论支柱和基本思路，但内生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ是否诱导了糖信号异常？这些糖信号的受体是什么是以什么方式作用等问题还需进一步深入探讨。