张晓燕，谢勇，祝宇，余世荣，王娇莉，杜鹏阳

[1.湖北省十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)药学部，十堰 442000；2.武当特色中药研究湖北省重点实验室，十堰 442000；3.兵兵宏康中药饮片(十堰)有限公司，十堰 442000]

青翘是木犀科连翘属连翘[forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl]的果实，在秋季初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干的药材[1-2]。青翘药材以野生为主，主产于陕西、山东、安徽、河北、山西、河南、湖北等地[3]。但长期以来各产区野生青翘一直处于自由采收，采青、抢青现象突出，缺乏有效管控的状态，导致不同产地青翘外观性状及有效成分含量等方面存在差异，各产区药材质量良莠不齐。青翘主要含有连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘苷、连翘酯素、芦丁、右旋松脂酚等化学成分[4]，是发挥抗菌、抗炎、解热、镇吐、镇痛、抗病毒、抗氧化生理活性的物质基础。笔者在本实验参考王姝君等[5-8]连翘活性成分含量测定方法，采用超高效液相色谱(UPLC)法建立青翘中连翘苷、连翘酯苷A 及芦丁一测多评含量测定方法，采用层次分析法(analytic hierarchy process，AHP)对3种成分权重进行积分，综合评价不同产地青翘质量差异。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters Acquity 超高效液相色谱仪(美国Waters 公司，包含四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA 检测器、Empower 工作站) ；电子分析天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；H1650-W微量台式高速离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)；2013QT超声仪(超声波清洗机)、药筛等。

1.2药物与试剂 连翘苷、连翘酯苷A、芦丁(四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为wkq18012210、wkq16060102、wkq18012501，含量均为98%)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。18批青翘药材采自山西、陕西、河南、湖北等地，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1色谱条件 ACQUITYULCRBEH C18色谱柱 ( 2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相乙腈 (A)-0.2% 甲酸溶液 (B)，梯度洗脱 ( 0～15 min，10%→30%A)；检测波长277，330 nm；流量0.3 mL·min-1；柱温 35 ℃；进样量 1 μL。色谱图见图 1。

2.2对照品溶液的制备 取连翘苷、连翘酯苷A、芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.28，0.21，0.21 mg·mL-1溶液，摇匀，低温、避光储存备用。

2.3供试品溶液的制备 取本品粉末[过三号筛，50目，筛孔内径：(180±7.6) μm)]约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶，精密加入70%甲醇15 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察 精密吸取“2.2”项各对照品溶液，制成连翘苷浓度为93 μg·mL-1、连翘酯苷A浓度为70 μg·mL-1、芦丁浓度为70 μg·mL-1的混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 μL，测定各峰面积。以进样量(μL)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得回归方程，见表1，连翘苷、连翘酯苷A、芦丁在表1中测定范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 取混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得连翘苷色谱峰RSD=1.58%(n=6)，连翘酯苷A色谱峰RSD=1.87%(n=6)，芦丁色谱峰RSD=1.74%(n=6)，表明该仪器精密度良好。

2.6重复性实验 取6份同一样品各约0.5 g，精密称定，按“2.3”项制备方法制备供试品，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱峰面积并计算RSD值。结果得连翘苷RSD=1.56%(n=6)，连翘酯苷A RSD=0.92%(n=6)，芦丁RSD=2.48%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.7稳定性实验 取同一供试品，按“2.3”项色谱条件分别于0，1，2，4，6，8，12 h进样，记录峰面积并计算RSD值，结果得连翘苷RSD=2.18%(n=6)，连翘酯苷A RSD=0.87%(n=6)，芦丁RSD=0.80%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8加样回收率实验 取已知含量连翘粉末约0.25 g，共6份，精密称定，置15 mL锥形瓶，分别精密加入连翘苷对照品3.650 mg，连翘酯苷A19.500 mg，芦丁对照品2.680 mg，再加70%乙醇定容，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样1 μL。计算加样回收率。结果见表2。

A.连翘苷对照品；B.连翘酯苷A对照品；C.芦丁对照品；D.青翘样品；1.连翘苷；2.连翘酯苷A；3.芦丁。

A.phillyrin control；B.forsythiaside A control；C.rutin control；D.sample of green fructus forsythiae；1.phillyrin；2.forsythiaside A；3.rutin.

Fig.1UPLCchromatogramsofgreenfructusforsythiae

表1 连翘苷、连翘酯苷A、芦丁回归方程

Table.1Linearrelationshipofphillyrin,forsythiasideAandrutin

测定成分回归方程R线性范围/μg连翘苷Y=207 543X-521.961.000 00.009 3～0.297 6连翘酯苷AY=429 304X-1611.21.000 00.007 0～0.224 0芦丁Y=298 262X-3089.40.999 90.007 0～0.224 0

表2 连翘苷、连翘酯苷A、芦丁加样回收率

Table.2Recoveryofphillyrin，forsythiasideAandrutin

测定成分取样量样品量加入量测得量mg回收率RSD%连翘苷260.503.6573.6507.19796.986254.753.6463.6507.28699.726256.503.6713.6507.23197.534256.253.6673.6507.27198.740254.003.6353.6507.26899.534257.503.6503.6507.29599.8631.23连翘酯苷A260.5019.55219.50038.92599.349254.7519.49419.50038.87499.385256.5019.62819.50038.90898.872256.2519.60919.50038.96699.267254.0019.43719.50038.90199.815257.5019.51319.50038.96399.7440.35芦丁260.502.6862.6805.26396.157254.752.6782.6805.32898.881256.502.6962.6805.26495.821256.252.6942.6805.24795.261254.002.6702.6805.29998.097257.502.6812.6805.34899.5151.82

2.9样品含量测定及质量评价 取来源于湖北、河南、山西、陕西4省18个野生青翘主产地的样品，其中湖北产区样品由本项目组于8月底采样，并按项目组研究的产地加工方法规范加工，其他产区于9月底委托连翘产地药商购于当地。18个样品统一按“2.3”项制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样测定，测得18批样品中连翘苷、连翘酯苷A、芦丁各成分含量见表3。采用AHP法进行积分，先对连翘各产地质量评价的决策建立层次结构模型，采用1～9 标度法对连翘苷、连翘酯苷A、芦丁3 项指标进行两两比较，按9分位比率评判各评价指标相对重要顺序，列举各评价指标的判断优先矩阵。再按几何平均法(根法)计算各指标的权重系数，得到连翘苷、连翘酯苷A、芦丁的权重系数分别为0.41，0.41，0.18。对求得的各个权重系数进行一致性检验，得到CI(一致性指标)=0，CR(随机一致性比率)=0(<0.1)，说明评价指标层的判断矩阵和单排序结果通过了一致性检验，所求得的权重系数有效，确定各有效成分的权重，再根据权重计算各样品的综合评分，结果见表3。

表3 各产地青翘中3种成分含量及质量综合评价

Table.3Contentandqualityevaluationofthreeingredientsingreenfructusforsythiaefromdifferentregions

序号产地连翘苷连翘酯苷A芦丁%综合评分1湖北省十堰市郧阳区①1.447.210.9995.552湖北省十堰市郧阳区②1.237.591.1293.703湖北省十堰市郧阳区③1.117.330.6881.824湖北省十堰市郧阳区④0.926.930.8677.165湖北省十堰市郧阳区⑤1.437.651.0598.596湖北省十堰市房县①0.876.120.4564.807湖北省十堰市房县②1.265.940.9983.628湖北省十堰市房县③1.216.980.7383.599湖北省十堰市郧西县①1.414.500.6674.8710湖北省十堰市郧西县②0.922.300.4459.0711湖北省十堰市丹江口市1.176.810.9484.9212湖北省十堰市张湾区1.086.830.9482.4613湖北省十堰市竹山县0.906.340.7070.8514陕西省商洛市丹凤县0.634.990.6054.3215河南省洛阳市嵩县0.613.270.4041.3216河南省三门峡市卢氏县0.693.380.4544.9917河南省安阳市林州市0.886.200.7770.6618山西省临汾市襄汾县0.493.350.3938.17

综合评分Ki=各样品连翘苷含量/连翘苷最高含量×0.41×100+各样品连翘酯苷A含量/连翘酯苷A最高含量×0.41×100+各样品芦丁含量/芦丁最高含量×0.18×100，i=1，2，3，……，18。

Comprehensive ScoreKi= the content of forsythin in each sample / the highest content of forsythin × 0.41 × 100 + the content of forsythiaside A in each sample / the highest content of forsythiaside A × 0.41 × 100 + the rutin content of each sample / the highest rutin content × 0.18 × 100,i= 1, 2, 3, …, 18.

3 讨论

3.1UPLC法测定连翘苷、连翘酯苷A、芦丁含量方法的优化 《中华人民共和国药典》2015年版连翘含量测定项下连翘苷及连翘酯苷A的供试品溶液需分开制备，连翘苷供试品溶液制备需经过静置过夜、提取、蒸干、过氧化铝柱、洗脱、浓缩至干、定容等步骤，测定2种成分处理供试品往往需要>3 d，耗时长，过程繁琐，样品回收率低。经过反复实验发现以70%甲醇超声提取40 min 时，采用 UPLC 结合梯度洗脱，用一个色谱条件同时检测3种成分，在检测波长277，330 nm时分别读取连翘苷、连翘酯苷A、芦丁的数据计算含量，简化了供试品制备步骤，有效提高了分析速度，提高了实验方法精密度及重复性，并且通过实验方法验证该方法测定连翘苷、连翘酯苷A的含量与《中华人民共和国药典》2015年版方法比较接近，因此该方法用于平行评价不同产地青翘的质量可行，同时为简便快捷、有效地监控青翘质量提供了一种新检测方法。

3.2各产区青翘质量综合评价 青翘是大宗清热解毒类中药材[9]。笔者在本实验中选择《中华人民共和国药典》2015年版连翘鉴别项连翘苷和连翘酯苷A含量及黄酮类成分芦丁作为质量评价指标。对3种成分重要程度按AHP法进行重要性评判，按各成分权重计算每个样品的综合评分，用综合评分来一测多评评价各产地青翘的综合质量。从实验结果来看，不同产区青翘药材中主要成分含量有一定差异性。湖北省十堰市郧阳区5批青翘样品综合评分平均达89.4分，普遍高于其他产区，尤其是连翘酯苷A含量高于其他产区。十堰市房县产区①号样采自30年树龄老树，连翘苷含量较低，是否与树龄有关，有待项目组后期进一步研究。郧西县2批样品中连翘酯苷A含量低于郧阳区很多，是否与地理环境、气候条件有关也有待后期进一步研究。山西、陕西、河南产区综合评分低于湖北省十堰市，可能与加工不规范、不能与项目组于湖北省十堰市产区同步平行采收时间及加工方法有关。从本实验结果可以看出，湖北省十堰市产区青翘综合质量优于其他产区，可能与该区一直是野生连翘药材传统产区，采收野生青翘一直是当地药农主要创收手段有关[10]。当地相关部门应重视规范连翘的采收时间及产地加工工艺，以保证该地区出产的道地野生青翘质量优质及均一，彰显该药材的道地性。