杨欣，李亚辉，沙宗阁，李尧锋，杨长福

(贵州中医药大学基础医学院，贵阳 550025)

乙型肝炎是危害人类健康的多发病之一，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起，我国是HBV感染高发区[1]。近年来，人们生活水平逐渐提高，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)发病率逐年升高[1-2]。目前，出现了慢性HBV感染合并NAFLD的患者，通常认为乙型肝炎和NAFLD具有协同作用，可加重肝脏损伤[3]。所以预防乙型肝炎和NAFLD同时发生，防止因协同损伤作用诱发肝脏纤维化、肝硬化和肝癌等疾病的发生有重要意义。

黄连(CoptischinensisFranch.)药用历史悠久，有关该药的研究主要集中在保肝、抗肿瘤和降压等方面[4]。已经有研究表明，黄连素、黄连复方、黄连水提取物等在肝损伤、肝硬化、肝癌中发挥重要作用[5]。由于中药化学成分众多，采用动物实验筛选抗HBV和NAFLD的活性成分及靶点工作量较大。随着科学技术的发展，网络药理学和分子对接技术的出现，多学科的相互交叉，为中医药的发展增添了新思想和新技术，同时降低了实验工作量和成本[6]。国内外对乙型肝炎和NAFLD之间的关联性及影响研究笔者较少见到。笔者在本研究基于网络药理学、分子对接探讨黄连防治乙型肝炎和NAFLD的分子机制，以期筛选最佳活性成分，为保肝药物的开发及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1在线软件与数据库 Cytoscape 3.5.1版软件(http：//www.cytoscape.org)；DrugBank数据库(http：//www.Drugbank.ca/)；可视化和集成发现的数据库(Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https：// david.ncifcrf.gov/)；基因比较数据库(Commparative Toxicogenomics Database，http：//ctdbase.org/)；中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmspsearch)；UniProt 数 据 库(http：//www.uniprot.org/uniprot/)；SYBYL2.1软件(Tripos)。所有软件运行于 Windows 操作系统平台下(64位)，本项目使用的分析软件均已获授权或为开源软件。

1.2活性成分潜在靶点筛选 在线TCMSP[7]，输入“黄连”，设置相关参数：参照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、类药性(drug likeness，DL)、相对分子质量(molecular weight，MW)、脂水分配系数(lipid-water partition coefficient，ALogP)筛选黄连活性成分。TCMSP人体靶标数据来自 DrugBank 数据库[8]。借助间接靶点预测(SysDT) 模型筛选黄连潜在靶标。采用随机森林(random forests，RF) 和支持向量机(support vector machine，SVM)建立预测模型。黄连基于TCMSP在化学成分名称中输化学成分，统计靶标蛋白数目。基因靶标通过CTD查找。输入黄连化学成分，显示潜在靶标基因名称。统计潜在靶标基因数目。将基因和蛋白名称输入UniProt 数据库，查找Uniport ID，为通路分析做准备。

1.3靶点通路分析 DAVID是基于WEB服务器的富集分析软件，可对靶标基因(蛋白)进行功能分析、疾病分析、通路分析。本研究基于DAVID 中的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG)对靶标进行通路富集分析，黄连活性成分84个靶点通过DAVID 6.8版在线进行分析，其数据库可以进行靶点整合，将靶点整合到相同通路中进行分析。结果得到靶标蛋白参与的所有途径，筛选出靶标蛋白显著参与的途径(P≤0.01)，通过Rstudio中的ggplot2绘制前25条通路，包括通路名称、Rich factor、富集分析的P值和Q值等。

1.4蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI)分析 PPI分析有助于从系统角度揭示疾病分子机制，发现新药靶点，筛选关键靶点。STRING数据库是一个搜索已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的数据库，可以通过蛋白名称(protein by name)、蛋白序列(protein by sequence)、多个蛋白名称(multiple proteins)和多条蛋白序列(multiple sequences)进行相互作用分析[8]。STRING用于字符串相关操作。基于实验数据、PubMed文本数据挖掘的结果、其他数据库数据，采用基因融合、系统进化谱、染色体临近等生物信息学方法进行预测，最后以综合打分形式衡量结果。对24个乙型肝炎靶点和15个NAFLD靶点进行PPI分析，将乙型肝炎和NAFLD通路中39个潜在靶标输入STRING，输入潜在靶点名称，选择人源。每一个节点代表一个蛋白，节点右上方为基因名称，每一条边代表潜在靶点之间的功能性关联。基于开源的复杂网络分析与可视化平台Cytoscape3.5.1版进行绘制，根据度(degree)的大小筛选关键节点[9]。

1.5小分子的优化处理 基于SYBYL对黄连小分子加氢、加电荷[10]，每个分子进行最低能量优化及加氢处理，优化次数为10 000，选择Tripos 标准分子力场和添加 Gasteiger-Hückel 电荷，基于 Powell能量梯度法优化得到最低能量构象，进行能量优化的目的是寻找配体分子的最低能量构象以模仿自然体系中的分子稳定构象，保存为SLN格式。

1.6黄连活性成分与靶标蛋白能量匹配 采用药物分子设计模拟 SYBYL2.1 软件的Surflex-Dock 模块完成分子对接研究[11-12]。选择具有实验数据支持的靶标蛋白与黄连活性成分进行分子对接。蛋白质结构数据库(protein databank，PDB，http：//www.rcsb.org/pdb )下载晶体结构[13]，结合文献优先选择复合了相应生物活性配体且分辨率较高的晶体结构[14-17]，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3 precursor，CASP3，PDBID：1RHQ)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1，PDBID：3RJR)、白细胞介素- 6(IL-6，PDBID：1ALU)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopro teimase-9,MMP9，PDBID：966C)、基质金属蛋白酶-3(MMP3，PDBID：1HY7)、促分裂素原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1，PDBID：2Y9Q)和促分裂素原活化蛋白激酶3(MAPK3，PDBID：4QTB)与黄连活性分子进行能量匹配，这些晶体分别在3.00 Å，3.05 Å，1.90 Å，1.90Å，1.40 Å，1.55 Å，1.50 Å的解象下以X衍射方法获得。将小分子结构数据库中的低能构象与靶标进行柔性对接，对接过程中阈值参数0.5，膨胀系数1，其他参数为系统缺省值。选用 AMBER7 FF99 力场进行能量优化；另外选择 Automatic 模式产生活性口袋，优化完毕后保存为 SFXC 文件作为对接文件，其他所有参数均采用SYBYL2.1默认值。利用Surflex-Dock分子对接模块的 Total-Score 打分函数对小分子与靶标相互作用进行评分，Total-Score 函数综合考虑了极性作用、疏水作用、焓和溶剂化等因素，该值越大，对接复合物越稳定，说明小分子化合物与大分子蛋白质的匹配结合作用越好。以 Total-Score 等于 5为阈值，挑选对接效果好的化合物。

1.7相互作用分析 Ligplot作为经典的配体与蛋白二维相互作用作图软件，应用较广泛，氢键和疏水作用基于HBPLUS程序计算，以2D形式展示结构。本研究基于Ligplot1.4.5软件，将黄连活性最高的化学成分穆坪马兜铃酰胺与RACα丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、MAPK3、MMP9、MMP3、TGF-β1、CASP3、MAPK1分别合并(Merg命令)为PDB格式(Program Data Base)保存，导入Ligplot软件，并自动计算形成的氢键、疏水作用和结构比对。

2 结果

2.1黄连活性成分筛选 在TCMSP数据库中参照OB≥40%、DL≥0.18、-2≤ALogP≤5、MW≤500筛选黄连化学成分，结果见表1。

表1 黄连化学成分

Table.1ChemicalcomponentofCoptischinensisFranch

中文名称英文名称OB/%DLMWALogP广玉兰内酯magnograndiolide63.710.19266.371.18穆坪马兜铃酰胺moupinamide86.710.26313.382.86盐酸巴马汀palmatine64.600.65352.443.65(R)-四氢小檗碱 (R)-canadine55.370.77339.423.40槲皮素quercetin46.430.28302.251.50甲基黄连碱worenine45.830.87334.373.73表小檗碱epiberberine43.090.78336.393.45黄柏酮obacunone43.290.77454.562.68

2.2黄连活性成分潜在靶标 基于TCMSP、CTD及 Uniport查找黄连化学成分潜在靶标，其中盐酸巴马汀潜在靶标14个，(R)-四氢小檗碱潜在靶标3个，槲皮素潜在靶标63个，甲基黄连碱潜在靶标7个，表小檗碱潜在靶标10个，黄柏酮潜在靶标14个，共111个潜在靶标。除去相同的潜在靶标，黄连化学成分共有潜在靶标84个(图1)。广玉兰内酯和穆坪马兜铃酰胺无潜在靶标，采用分子对接进一步研究。

红色节点：靶标；蓝色节点：化学成分。

Red node：target；blue node：chemical component.

Fig.1Interactionnetworkofcomponents-targets

2.3潜在靶标通路分析 采用DAVID 数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)对靶标蛋白进行通路注释，得到靶标蛋白所参与的所有途径，筛选出靶标蛋白显著参与的途径(P≤0.01)，84个差异蛋白共筛选出代谢途径83条，采用R语言的ggplot2输出前25条通路。25条通路中包括乙型肝炎(P-Value=3.5E-19)和NAFLD(P-Value=9.9E-8)通路(图2)。

2.4乙型肝炎、NAFLD通路共有靶标分析 NAFLD通路包括潜在靶标15个，乙型肝炎通路包括潜在靶标24个。通过构建通路-靶标网络模型(图3)，发现CASP3、CASP8、 TGF-β1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-6、转录因子p65(transcription factor p65，RELA)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、转录因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、AKT1、细胞凋亡调节因子BAX(apoptosis regulator，BAX)为乙型肝炎和NAFLD通路共有靶点。

图2 潜在靶标通路分析

Fig.2Pathwayanalysisonpotentialtarget

红色节点：疾病名称；蓝色节点：靶标蛋白；黄色节点：乙型肝炎和NAFLD共有靶标蛋白。

图3 通路-靶标网络模型

Red node：disease name;blue node：target protein;yellow nod：common target protein of HB and NAFLD.

Fig.3Networkmodelofpathway-target

2.5PPI分析 PPI分析结果显示：整个网络以MAPK1、细胞凋亡调节因子Bcl-2(Apoptosis regulator Bcl-2)、IL-6、MAPK3、AKT1(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)(degree>26)为中心节点紧密关联。去掉中心节点，整个网络涣散。进一步明确代表NAFLD和乙型肝炎的靶标相互关联(图4)。

2.6分子对接 Surflex-Dock 具有速度快、准确性高等特点，对接结果以Total Score、Crash和Polar 等参数值输出。Surflex-Dock 打分函数是以-log10 为单位模拟结合能力，配体与受体结合稳定性以Total Score>5为阈值进行评价(表2)，黄连4个活性成分[穆坪马兜铃酰胺、盐酸巴马汀、槲皮素、 (R)-四氢小檗碱]能同时调节≥3个靶标蛋白，化学成分结构见图5，通过分子对接进一步明确其关键靶标蛋白为MAPK1、MAPK3、MMP3和CASP3。

绿色：乙型肝炎和NAFLD通路共有靶标；红色：乙型肝炎靶标；蓝色：NAFLD靶标

图4 靶标蛋白相互作用

Green：common targets of HB and NAFLD；Red：Hepatitis B targets；blue：NAFLD targets.

Fig.4Interactionoftargetprotein

2.7相互作用分析 本研究基于Ligplot1.4.5版软件自动计算形成的氢键、疏水作用和结构比对(图6)。化学成分穆坪马兜铃酰胺与7个关键靶标蛋白形成16氢键，63个氨基酸位点。可以推测表3中这些氨基酸残基可能要寻找AKT1、 CASP3、TGF-β1、MAPK1、MAPK3、MMP9和MMP3的重要残基，它们在决定酶的催化特性中起到了重要作用。

3 讨论

中药具有活性成分多、调节靶点多和药理作用多等特点。网络药理学和计算虚拟平台为化合物的筛选提供了较好的补充和替代手段。本研究基于整合平台，研究了黄连保肝物质基础，明确黄连中穆坪马兜铃酰胺、盐酸巴马汀、槲皮素、 (R)-四氢小檗碱是治疗NAFLD、乙型肝炎主要活性成分。已经有研究表明[18-21]，槲皮素、小檗碱对急性肝损伤和NAFLD有保护作用。乙型肝炎患者肝脏解毒功能降低，肝脏合成、代谢、排泄等功能失常，甚至导致肝细胞坏死，使机体出现肝功能失代偿体征。NAFLD主要特征为肝细胞大泡性脂肪变性综合征，根据炎症和纤维化级别分为单纯性脂肪肝、肝硬化、NAFLD。NAFLD发病率逐年上升，与肥胖、血脂异常、糖尿病、代谢异常等诸多疾病关系密切。影响身心健康，预防和治疗NAFLD、乙型肝炎成为临床难题。目前，临床主要采用降脂药、调节胰岛素、控制体质量等方式治疗上述疾病，往往不良反应较大。笔者在本研究采用分子对接明确黄连活性成分，通过多成分-多靶点协同发挥治疗NAFLD和乙型肝炎作用，明确MAPK1、MAPK3、MMP3和CASP3可能是黄连治疗NAFLD和乙型肝炎关键靶点，其中CASP3为NAFLD和乙型肝炎的共有靶点。CASP3在多种疾病中发挥重要作用，影响细胞增殖、分化、凋亡等。研究表明，乙型肝炎患者CASP3高表达，CASP8和CASP9可以激活CASP3，CASP3主要执行促细胞凋亡作用[22]；MAPK1和MAPK3在MAPK信号通路起着重要作用，已知肝细胞癌发生、发展与MAPK信号通路最为密切[23]。黄连为经典清热解毒中药，保肝效果值得进一步研究，本研究可为细胞实验和动物实验靶点选择、组分配伍提供理论参考。

表2 活性成分与靶标蛋白分子对接

A.广玉兰内酯；B.穆坪马兜铃酰胺；C.盐酸巴马汀；D.(R)-氢化小檗碱；E.槲皮素；F.甲基黄连碱；G.表小檗碱；H.黄柏酮。

图5 黄连化学成分结构式

A.magnograndiolide；B.moupinamide；C.palmatine；D.(R)-canadine；E.quercetin；F.worenine；G.epiberberine；H.obacunone.

Fig.5StructuralformulaofchemicalcompositioninCoptischinensisFranch

表3 穆坪马兜铃酰胺与靶标蛋白形成的氢键及疏水作用

图6 穆坪马兜铃酰胺与靶标蛋白相互作用分析

Fig.6Analysisoftheinteractionbetweenmoupinamideandtargetprotein