石新华

(新郑市中医院，河南 新郑 451100)

嘧啶是核酸合成和DNA修复的重要组成部分。在增殖正常细胞和肿瘤细胞中，从头进行嘧啶合成途径的激活对于满足DNA复制所需的核苷酸的高需求是至关重要的[1-2]。在动物体内，该途径的前3个反应由CAD催化[3]。CAD是启动和控制动物嘧啶从头开始生物合成的多功能蛋白。CAD的上调对细胞增殖至关重要。因此，CAD有可能被用作抗肿瘤靶标。最近的研究表明靶向CAD基因可以改善胶质瘤患者的预后[4]。

鉴于肿瘤发生的复杂性，对任何目标基因进行泛癌表达分析并评估其与临床预后和潜在分子机制的相关性非常重要。我们的研究首次使用症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库对CAD基因进行了泛癌分析，以探索CAD基因在不同组织中的表达以及在肿瘤临床预后中的潜在分子机制。

1 资料与方法

1.1 数据的获取与预处理从TCGA数据库下载了33种肿瘤的转录组测序数据，同时下载了相应患者的临床信息、肿瘤突变负担和微卫星不稳定性的信息。33种肿瘤包括：肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma，ACC)、膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、乳腺浸润癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、宫颈鳞癌和腺癌(cervical and endocervical cancers, CESC)、胆管癌(cholangiocarcinoma, CHOL)、结肠癌(colon adenocarcinoma, COAD)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma, DLBC)、食管癌(esophageal carcinoma, ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)、头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma ,HNSC)、肾嫌色细胞癌(kidney chromophobe ,KICH)、肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma ,KIRC)、肾乳头状细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma ,KIRP)、急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia ,LAML)、脑低级别胶质瘤(brain lower grade glioma, LGG)、肝细胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma ,LUAD)、肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma ,LUSC)、间皮瘤(mesothelioma ,MESO)、卵巢浆液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma ,OV)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma ,PAAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma ,PCPG)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma ,PRAD)、直肠腺癌(rectum adenocarcinoma ,READ)、肉瘤(sarcoma ,SARC)、皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma ,SKCM)、胃癌(stomach adenocarcinoma ,STAD)、睾丸癌(testicular germ cell tumors ,TGCT)、甲状腺癌(thyroid carcinoma ,THCA)、胸腺癌(thymoma ,THYM)、子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma ,UCEC)、子宫肉瘤(uterine carcinosarcoma, UCS)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma ,UVM)。

1.2 预后评估与统计学处理采用R软件进行统计学分析。用Cox回归分析评估每种肿瘤类型的CAD基因表达与患者总生存期、疾病特异性生存期和疾病无进展生存期之间的相关性。根据CAD基因表达的中位值，将患者分为CAD高表达组与CAD低表达组，使用Kaplan -Meier方法绘制每种肿瘤类型的患者生存曲线，使用log-rank检验分析生存状况。使用的“ESTIMATE”软件包计算每例患者的基质评分和免疫评分来评估患者的肿瘤微环境[5]。使用“CIBERSORT”算法计算每例患者22种免疫细胞浸润情况[6]。使用Spearman相关评估CAD基因表达与靶标间的相关性(基质评分，免疫评分，免疫细胞浸润，肿瘤突变负荷，微卫星不稳定)。使用t检验评估肿瘤与正常组织之间的CAD基因表达水平。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各种正常组织和肿瘤组织中的CAD表达水平在TCGA数据库中共有24种肿瘤存在相应的正常组织作为对照。在这24种肿瘤中有19种肿瘤的CAD基因表达与正常组织比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，KICH中的CAD基因表达低于对应的正常组织，其余18种肿瘤中的CAD基因表达均高于对应的正常组织。见图1。

图1 33种肿瘤及其相应正常组织中CAD基因表达的箱图[1)P<0.05]

2.2 CAD基因表达水平与预后之间的关系CAD基因表达是ACC、BLCA、COAD、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO、SARC、SKCM、UCEC的危险因素，而CAD基因表达是READ的保护因素(P均<0.05)。进一步根据CAD基因表达的中位值将33种肿瘤患者分为CAD高表达组与CAD低表达组后进行生存分析发现，在ACC、KIRC、LGG、LIHC、MESO、SARC、UCEC患者中，CAD高表达组患者与CAD低表达组患者间的总体生存期比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。比较一致的是，CAD高表达组患者的总体生存期均小于CAD低表达组(P均<0.05)。考虑到总体生存期可能会受到非肿瘤死亡的影响，我们进一步评估了CAD基因表达与疾病特异生存间的关系。相似的是，CAD基因表达是ACC、BLCA、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO、PCPG、PRAD、SARC、SKCM、THCA的危险因素。在GBMLGG、KIRC、LIHC、MESO、PRAD、UCEC、UVM患者中,CAD高表达患者疾病特异生存期减少(P均<0.05)。CAD基因表达与疾病无进展生存期的关系研究结果显示，CAD基因表达是ACC、BLCA、KIRC、脑LGG、LIHC、MESO、PAAD、PCPG、PARD、SARC、UCEC、UVM的危险因素。根据CAD基因表达的中位值将患者分为2组，在ACC、GBMLGG、LIHC、MESO、PCPG、PRAD、UCEC、UVM患者中，CAD高表达组疾病无进展生存期较CAD低表达组。见图2～4。

图2 33种肿瘤中CAD基因表达与总体生存期关系的森林图(X轴刻度线遵循对数刻度)

图3 33种肿瘤中CAD基因表达与疾病特异生存期关系的森林图(X轴刻度线遵循对数刻度)

图4 33种肿瘤种CAD基因表达与疾病无进展生存期关系的森林图

2.3 CAD基因表达与肿瘤微环境间的关系CAD表达与一些肿瘤的基质评分、免疫评分密切相关。在11种肿瘤中CAD基因表达与基质评分呈负相关，其中LAML、SARC、TGCT最显著(r=-0.42、-0.42、-0.47，P均<0.05)。在14种肿瘤中CAD基因表达与免疫评分呈负相关，其中LAML、OV、SARC最显著(r=-0.39、-0.38、-0.33，P均<0.05)。在11种肿瘤中CAD基因表达与M0巨噬细胞的浸润呈正相关，其中LIHC、SARC、SKCM最显著(r=0.24、0.24、0.21，P均<0.05)。

2.4 CAD基因表达与肿瘤突变负荷和微卫星不稳定间的关系33种肿瘤中，ACC、BRCA、HNSC、KICH、KIRC、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、SKCM、STAD等12种肿瘤的CAD基因表达与肿瘤突变负荷均存在显著正相关关系，其中ACC、KICH、LUAD的相关系数最高。33种肿瘤中，BLCA、CESC、COAD、DLBC、ESCA、GBM、KICH、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、OV、READ、UVM等14种肿瘤的CAD基因表达与微卫星不稳定存在显著相关性，DLBC、COAD、READ中CAD基因与微卫星不稳定呈负相关，而剩余11种肿瘤中CAD基因表达与微卫星不稳定呈正相关，其中KICH、LUSC、UVM的相关系数最高。见图5。

图5 CAD基因表达与肿瘤突变负荷(A)和微卫星不稳定(B)的关系[1)P<0.05]

3 讨论

本文结果显示，CAD基因在多种肿瘤组织中表达增高，并且这种高表达与这些肿瘤较差的总体生存期和疾病特异性生存期有关。例外的是，当将CAD基因视为连续性变量时，CAD基因表达是COAD的保护因素。此外，部分患者中CAD基因表达与疾病进展相关，其中CAD基因高表达患者肿瘤复发较早。因此，需要加强对这些患者的护理与随访。识别出高危患者，制定个性化治疗方案，加强对这部分患者的护理与随访将有希望改善其预后。CAD是启动和控制动物嘧啶从头开始生物合成的多功能蛋白。嘧啶是核酸合成和DNA修复的重要组成部分。在增殖正常细胞和肿瘤细胞中，从头进行嘧啶合成途径的激活对于满足DNA复制所需核苷酸的高需求是至关重要的。尽管先前有研究证实了CAD基因表达与LIHC、LUAD、PRAD等肿瘤的不良预后有关，但尚未有基于泛癌数据的研究[7-9]。我们的研究发现了CAD基因表达与各种肿瘤之间的相关性，包括与肿瘤生存和预后的明确联系，使其成为用于肿瘤监测和进一步研究的生物标志物。

浸润的基质细胞和免疫细胞构成肿瘤组织中正常细胞的主要部分，在肿瘤生物学中起着重要作用。我们使用“ESTIMATE”算法评估了33种肿瘤患者的基质评分和免疫评分，并探索了CAD基因表达与两者的关系。我们的相关分析的结果显示，在大部分肿瘤中，CAD基因表达与基质评分、免疫评分呈负相关。即CAD基因高表达患者基质评分、免疫评分较低。此外，先前的研究表明，在大部分肿瘤中，高基质评分、免疫评分与低肿瘤纯度相关和良好的预后相关，这与我们的结果一致[10-12]。另外，我们通过“CIBERSORT”评估患者的免疫细胞浸润情况，并探索CAD基因表达与免疫细胞浸润间的关系。结果显示，在许多肿瘤中CAD基因表达与M0巨噬细胞浸润呈正相关。一致的是，最近的研究表明巨噬细胞浸润通常与免疫抑制性微环境有关。此外，研究[13-15]表明高M0巨噬细胞浸润与多种肿瘤的不良预后相关。总之，CAD基因表达与多种肿瘤的肿瘤微环境密切相关。尽管先前的研究[2]表明，嘧啶合成对于T淋巴细胞增殖至关重用。遗憾的是，CAD基因影响肿瘤微环境的确切机制尚未确定，因此需要进一步探究CAD基因影响肿瘤微环境的机制。

我们还研究了CAD基因表达与肿瘤突变负荷和微卫星不稳定间的关系。如今已证实肿瘤突变负荷和微卫星不稳定可以预测患者的多种药物反应，特别是免疫检查点抑制剂类药物[16-18]。研究[19-21]表明，高肿瘤突变负荷、微卫星不稳定与良好的免疫检查点抑制剂药物反应相关。而我们的结果显示，在KIRC、LUAD、LUSC等肿瘤中CAD基因表达与肿瘤突变负荷和微卫星不稳定呈正相关。这提示CAD基因表达可能是潜在的药物反应指标，需要进一步的研究来证明这一结果。

尽管我们的研究提供了CAD基因参与肿瘤发生和肿瘤细胞免疫环境调节的有用信息，但其确实存在一些局限性。首先，作为一种纯粹的生物信息学分析，其完全依赖于开放存取数据库中可用的信息，而没有通过实验进行确认。在我们的研究中，CAD基因表达的评估完全基于上述数据库，即使这可能无法反映功能蛋白的水平。例如，转录后修饰和(或)调节的蛋白水解作用可能在正常细胞或肿瘤细胞中影响蛋白质活性。未来的研究将侧重于通过实验验证我们的数据，并探索CAD基因在肿瘤发生中的可能机制。其次，CAD基因影响肿瘤微环境的途径尚未知，需要可靠实验证明CAD基因与肿瘤免疫微环境间的联系。

我们的结果表明，CAD基因与多种肿瘤的发生、发展密切相关。在多种肿瘤中CAD基因高表达患者预后差。因此，对于CAD基因高表达患者应加强护理与随访。CAD基因表达与肿瘤微环境有密切联系。