崔秀玉 周 岩,2

(1.北京脑重大疾病研究院帕金森病研究所，首都医科大学脑重大疾病研究中心，北京 100069)(2.首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京 100069)

直接向脊髓输送药物技术的出现给科学家探讨脊髓功能、药物的神经毒性、疼痛传递过程及镇痛机制提供了无限的可能性。在镇痛领域，直接鞘内给药方法的建立给临床患者提供了新的镇痛方式的选择，尤其是不能进行全身麻醉的患者。直接鞘内给药使药物仅局限于脊髓局部，不但用药量少，而且也避免了全身毒副作用。鞘内给药的另一个优势是不能通过血脑屏障的药物可以直接髓鞘内给药[1]。实验研究中，鞘内给药方式可以分为一次性和慢性多次。一次性给药方式为腰椎直接穿刺法，慢性多次给药时除了反复直接腰椎穿刺外，另一种方法是鞘内置管，也称为蛛网膜下腔置管[2]。多次反复急性腰椎穿刺不但增加了实验者的操作次数，且易造成反复损伤和感染，所以需要慢性鞘内给药时多采用鞘内置管术。目前鞘内置管术可以分为：经枕寰膜鞘内置管、腰骶部椎间孔鞘内置管。

鞘内置管后，传统给药方式是经置管末端反复多次给药。近些年由于微型渗透泵的出现，可将置管末端与微型渗透泵相连，提供了一种鞘内连续给药方法的选择。在诸多的实验动物中，大鼠是使用最多的实验动物，占实验脊椎动物的80%以上[3]，因此，本研究应用大鼠作为研究主体，拟应用经枕寰膜置管、腰椎椎间孔置管、经枕寰膜置管+微型渗透泵、腰椎椎间孔置管+微型渗透泵四种鞘内给药模型，对比4种模型的优劣性，为慢性鞘内给药方式的选择提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取成年健康、体质量250～300 g的雄性Sprague-Dawley大鼠72只，由首都医科大学动物实验中心提供(SYXK(京)2018-0003)。动物随机分成6组：经枕寰膜置管组(A)、腰椎椎间孔置管组(B)、经枕寰膜置管+微型渗透泵组(C)、腰椎椎间孔置管+微型渗透泵组(D)，每组15只大鼠。枕寰膜置管(E)和腰椎椎间孔置管(F)两组假手术组，每组6只。 动物饲养条件：室温23～24°C，12 h/12 h明暗循环，每笼饲养1只动物，可自由获取食物和水。动物操作规程遵照首都医科大学动物保护与使用委员会的规定执行。实验结束后腹腔注射戊巴比妥钠深麻处死动物(200 mg/kg体质量)。

1.2 主要仪器设备与试剂

SR-6R型脑立体定位仪(Narishige, Japan)；rotarod转棒仪(Ugo Basile,Italy)；von frey足底机械刺激仪(Ugo Basile, Italy)；Plantar Test足底热刺激仪(Ugo Basile，Italy)微型渗透泵(Alzet Osmotic Pump，USA)； PE10 (Polyethylene tubing, USA)；戊巴比妥钠(sigma, USA)。

1.3 经枕寰膜鞘内置管

按照文献的方法进行经枕寰膜鞘内置管[4-5]。戊巴比妥钠(40 mg/kg，i.p.)麻醉下，将大鼠固定于脑立体定位仪，剃毛，消毒。找到枕骨与顶骨之间的连接骨缝，正中线沿骨缝上下缘切开约1 cm的皮肤切口，钝性分离皮下筋膜，暴露肌肉。沿骨缝边缘将附着的肌肉分别向左右两侧钝性剥离，此时可见白色的枕骨。沿枕骨向尾侧钝性剥离肌肉及筋膜可暴露附着于枕骨下缘和寰椎的枕寰膜(图1)。继续剥离肌肉和筋膜，直至枕寰膜清晰透明。用尖端弯曲的注射器针头沿枕骨下缘横向轻轻划破枕寰膜，可见清亮脑脊液溢出，将PE10导管经切口处尽量水平从头侧向尾侧插入。插入前需要让鼠头前倾，让下巴贴近胸。插入时同时牵拉鼠尾尽量使大鼠后脑和脊椎呈水平状态。插入过程中出现阻力加大，应将导管撤后一点调整导管方向/动物体位或者向内注射1～3 μL人工脑脊液后再慢慢插入。导管插入前应测量容量并充满生理盐水或人工脑脊液。导管插入预期长度后，缝合法或者阻隔法将导管锚定于肌肉或皮肤内，然后将游离端从头顶皮肤穿出， 逐步缝合肌肉、筋膜和皮肤，封闭导管末端，消毒。小心将处于麻醉状态的大鼠置于笼内，保温待醒，单笼饲养。7 d后合格者方可进行后续实验。

图1 经枕寰膜置管示意图注：蓝色箭头：枕骨，黄色箭头：枕寰膜Fig.1 Diagram of catheter implantation throughatlanto-occipital membraneNote：blue arrow: occipital bone；yellow arrow:atlanto-occipital membrane

7 d恢复期中密切观察大鼠状态。若插管时造成神经或脊髓损伤，大鼠会立即表现出跛行或瘫痪。其它不良状态包括眼睛鼻子炎性分泌物、毛色发黄蓬乱、体质量下降、缺乏活力，出现以上症状的大鼠应剔除实验。

经枕寰膜置管联合应用微型渗透泵(Alzet Osmotic Pump)时，导管置入成功后缝合筋膜及肌肉，游离端接入已经处理好的微型渗透泵。将微型渗透泵放入后颈处皮下扩张而成的囊中，缝合皮肤。

1.4 腰骶部鞘内置管

按照文献[6]的方法并加以改变以利于微型渗透泵的植入。大鼠麻醉方法同上，大鼠麻醉后置于手术台上，常规备皮消毒。实验者用左手拇指和中指分别触摸大鼠双侧髂嵴并向两侧绷紧皮肤，食指于两侧髂嵴连线同一水平触摸大鼠脊椎，触及的最高点即为L6 棘突(图2)。以L6棘突为中点做一约1 cm的纵向切口，钝性分离筋膜及脊椎两边的肌肉，去掉L6棘突。此时可见L6与L5之间的椎间孔，用弯针小心刺破椎间孔的硬脊膜，可见清亮脑脊液流出。将充盈生理盐水的PE10导管小心从椎间孔水平向头侧端插入约3 cm。阻隔法将导管游离端固定于皮肤，逐层缝合肌肉、筋膜及皮肤。封闭导管末端，消毒。小心将处于麻醉状态的大鼠置于笼内，保温待醒，单笼饲养。1 d后合格者方可进行后续实验。

经腰椎椎间孔联合应用微型渗透泵时，接入微型渗透泵放置于皮下囊袋中。

图2 L6棘突示意图注：红线：左右两侧髂嵴连线，与脊椎相交点即为L6棘突Fig.2 Diagram of L6 lumbar spinousNote：Red line: connecting line between left and right iliac crest,intersection point with the spine is L6 lumber spinous

1.5 行为学检测

1.5.1痛行为学检测:所有痛行为学测试之前，大鼠均需提前适应测试环境3 d，每天2 h。

分别测试各组大鼠术前及术后1 周单足的热刺激缩足反射潜伏期(paw withdrawal lantency, PWL)和机械刺激缩足反射阈值(paw withdrawal threshold, PWT)。采用von frey系统测定机械刺激缩足反射阈值。动物不发生缩足反射最大施加压力为50 g，以免损伤大鼠足底。每个时间点至少进行3次测量，两次测量间隔3 min。3次测量平均值被视为该时间点的机械刺激缩足反射阈值。

应用辐射热照射法检测大鼠热刺激缩足反射潜伏期。每个时间点重复测量3次，间隔3 min，取其均值作为此时间点的热刺激缩足反射潜伏期。为保护足底皮肤，照射20 s后自动断开。

剔除术前热刺激缩足反射潜伏期和机械刺激缩足反射阈值过低的大鼠，合格大鼠进行后续实验。

1.5.2运动能力行为学检测:参照文献方法[7]，采用Rotarod转棒仪检测大鼠手术前后运动能力的变化。测试前2 d 大鼠在10 r/min匀速转棒上每天适应2次，每次2 min，连续适应2 d。剔除运动能力有问题大鼠。

手术前及术后1 周进行运动能力测试。将大鼠放置于0 r/min转棒上，采用加速模式，每10 s增加3 r/min，直至终速达60 r/min，终止时间为300 s，记录大鼠落棒时间。每只大鼠测试3次，间隔时间20 min，取其均值。

痛行为学及运动能力行为学检测反应术后脊髓神经是否受到损伤。

1.6 统计方法

数据均表示为均数±标准误(mean±S.E.M)。统计方法采用GraphPad Prism统计软件的双因素方差分析(two way ANOVA)，然后进行两两比较(Tukey’s)检验。显著性水平：P<0.05。

2 结果

2.1 经枕寰膜置管和经腰椎椎间孔置管对大鼠致死、致瘫和体质量的影响

一般情况观察：经枕寰膜置管的存活大鼠手术恢复期长，手术成功的大鼠5～7 d后基本恢复术前状态。15只行经枕寰膜置管手术大鼠死亡1只(术后未苏醒)；致瘫2只；鼻口炎性分泌物2只；毛色发黄、体质量降低、精神萎靡4只(含口鼻炎性分泌物2只)；全部未脱管。7只大鼠(近50%)不合格，余8只合格可进行后续实验(表1)。

表1 不同置管手术方式对大鼠致死、致瘫、一般状态的影响Table 1 Effect of different catheterization on death,paralysis and weight loss of rats

经腰椎椎间孔置管的大鼠术后恢复期短，1～2 d即基本恢复术前状态。15只行腰椎椎间孔置管的大鼠全部存活，未见致瘫。一般情况良好，未见口鼻炎性分泌物、体质量降低及精神萎靡。由于置管游离端位于腰骶部，大鼠容易将置管咬掉或拔出，共有5只大鼠脱管。余10只大鼠可进行后续实验(表1)。

枕寰膜置管+渗透泵组，一般情况和单纯枕寰膜置管类似(表1)。

腰椎椎间孔置管+渗透泵组一般情况和单纯腰椎椎间孔置管一样，无致死、致瘫，一般情况良好。由于渗透泵置于皮下，全部未脱管。15只大鼠均可进行后续实验。

各组可用于后续实验的大鼠，其术前、术后体质量分别与其它组术前、术后相比，差异无显著性。同样，组内术前、术后体质量变化差异也无显著性(图3)。

图3 各组大鼠术前、术后体质量变化Fig.3 Weights of rats before and after surgery

2.2 经枕寰膜置管和经腰椎椎间孔置管对大鼠基础痛阈的影响

各组大鼠术前PWL和PWT组间、组内差异均无显著性，表明术前各组大鼠的基础痛阈无明显差别。

经枕寰膜置管和腰椎椎间孔置管两组的假手术组大鼠手术前后热刺激和机械刺激基础痛阈未发生显著变化。单纯手术不置管并未影响大鼠基础痛阈。

经枕寰膜置管术后1 周， PWL和PWT降低，与术前和假手术组相比差异具有显著性(P<0.01，图4A,4B)。提示经枕寰膜置管可导致大鼠产生痛敏。并且经枕寰膜置管大鼠的PWL、PWT也显著低于经腰椎椎间孔置管大鼠，差异显著(P<0.01)。

同样，在术后1 周 检测腰椎椎间孔置管大鼠的PWL和PWT，与术前和假手术组相比，置管大鼠的痛阈未见明显降低，统计学处理差异无显著性(P>0.05)。

经枕寰膜置管可降低大鼠基础痛阈，产生痛敏。而经腰椎椎间孔置管不影响大鼠基础痛阈。

2.3 经枕寰膜置管和经腰椎椎间孔置管对大鼠转棒运动能力的影响

术前及术后1周分别检测各组大鼠转棒运动能力。结果如图4C所示，各组大鼠术前转棒时间统计学上差异无显著性。经枕寰膜置管组及经枕寰膜置管+微型渗透泵组在术后转棒时间显著低于术前及其它术后组，提示经枕寰膜置管损伤脊髓神经组织，影响大鼠的运动能力。

图4 不同置管方式对大鼠基础痛阈及运动能力的影响注： 与同组术前比较,**P<0.01, ***P<0.001;与A, B, D, F组术后比较, ##P<0.01, ###P<0.001Fig.4 Effect of different catheterization on painbehavior and rotarod performanceNate：compared with before surgery in the same group,**P<0.01,***P<0.001; compared with after surgery in A, B, D, F groups,##P<0.01, ###P<0.001

3 讨论

经枕寰膜置管和腰椎椎间孔/穿刺给药仍是目前实验研究中常规使用的向鞘内给药的两种方式[8-13]，由于经腰椎椎间孔脱管率很高的缺点，实验者更愿意采用操作难度大，易造成神经损伤的经枕寰膜置管的方式。

经枕寰膜置管术最早在1976年由Yaksh和Rudy报道[4]。这项技术彻底改变了对疼痛和镇痛的研究，其广泛应用极大地促进了我们对脊髓生理功能、镇痛、慢性疼痛和阿片类药物耐受过程的理解。在麻醉下进行手术、导管定位，药物可以以定点的方式输送至特定位置。实验完成后，可以将染料注射至与药物完全相同的位置，用于导管和药物放置的组织学验证。这种方法允许多次甚至连续(连接微型渗透泵)地向不同脊髓水平输入药物，不需要反复多次地进行腰椎穿刺，避免了反复穿刺可能造成的神经损伤。

本置管术的缺点也很明显，首先要对动物进行手术，不但费用增加且与单次穿刺相比，实验者的劳动强度也增加。其次，与腰椎穿刺相比，动物在术后需要相对较长的恢复期，一般来说需要5～7 d。最后也是最严重的缺点是所置入导管需要从颈髓经胸髓到达腰髓，由于髓鞘腔狭窄容易对脊髓造成压迫性损伤[14]，导管尖端易形成瘢痕组织[15]，且易引发炎症反应[16]。这些损伤可致动物一侧甚至双侧后肢的跛行乃至瘫痪。另外，植入导管可发生脱管或者移位，有时甚至会移至脊髓腹侧。这就需要实验后对每只实验动物进行导管位置的确认，从实验数据中剔除导管移位的个例。导管植入引起的脊髓损伤，鞘内出血、位置移位及脱管、髓鞘内炎症等并发症可能造成20%～30%的实验动物数据流失[14-16]。该置管术另一个比较显著的劣势是植入导管有一定的难度和技巧，实验者必须经过反复练习。即使经过培训和练习的实验者仍不能保证全部的实验动物均能符合实验需要。本实验共15只大鼠行经枕寰膜置管术，由于死亡、偏瘫、体质量降低原因，仅余8只可进行后续实验，造成实验动物不必要的痛苦和浪费。术后7 d，可进行后续实验的大鼠其运动能力下降，后足基础痛阈降低，说明即使该组大鼠未发生明显瘫痪及健康方面问题，但其运动行为学和疼痛行为学仍发生显著变化，应引起进行相关领域研究者的注意。

腰骶部鞘内置管术是Martin等在1984年首次提出[6]，目前文献中腰骶部鞘内置管方法基本沿用了此方法。与经枕寰膜置管相比，此法显著降低了脊髓压迫及神经根损伤等创伤，行为学上不会出现软瘫及瘫痪等神经受损的表现。动物体质量、毛色、状态都保持正常[16]。但此法显著的一个缺点是大鼠极易容易将留置管游离端咬掉，致使后续实验无法进行。正如本实验观察结果，约三分之一的大鼠因此而退出实验。该方法要求操作者必须有一定的经验积累，经皮肤、皮下肌层、黄韧带和硬脊膜进行盲穿，这给操作者带来一定的挑战。为了降低操作难度并给微型渗透泵创造植入空间，本实验将腰椎棘突去掉，使得椎间孔暴露在操作者视野中，便于操作。

不管是经枕寰膜置管还是腰骶部鞘内置管，对动物进行慢性实验需要反复多次给药时，需要留出较多时间安抚动物，趁大鼠不反抗时尽快将药物注入。单次重复给药也使得体内药物浓度出现峰谷。为了解决脱管和反复多次给药的问题，本实验联合应用微型渗透泵。腰椎椎间孔结合微型渗透压泵的方法完全改善了大鼠咬掉置管游离端的弊端，15只行该方法的大鼠全部可用于后续实验。结合微型渗透泵的方法不但避免了反复给药繁琐的缺点，动物也免于反复的惊吓。由于使用了渗透泵，药物浓度也始终维持同一水平。根据给药时间的需要，可以选择不同规格的渗透压泵，基本可以满足持续给药3 d至28 d的需求。

不管是枕寰膜置管还是腰椎椎间孔，由于所置导管末端均裸露于皮肤之外，术后为了避免大鼠啃咬脱管只能单笼饲养。其缺点一是占用太多饲养空间，增加饲养人力和物力；二是慢性实验时，长期单笼饲养易至大鼠出现社会孤立综合征，导致行为学检测及实验失败[17]。使用微型渗透泵置于皮下可以多只同笼饲养，避免了以上两个缺点。

腰椎椎间孔结合微型渗透泵术后大鼠无致死、致瘫，状态佳，而且动物恢复时间也比较短，24 h即可进行后续实验。此法可用于临床药代及药物毒副作用的研究，应用前景广泛。