张贵贤 李木松 魏媛媛 秦 维 陈 晖

(保定市传染病医院 1. 结核二科 2. 五病区 3. 四病区 4. 六病区， 保定 071000)

肝纤维化(liver fibrosis，LF)是由各种原因引起的肝脏中纤维和结缔组织增生沉积和纤维分解下降引起的[1]。Caspase是一类富含半胱氨酸的蛋白酶，其中Caspase-12是参与细胞凋亡的主要蛋白，并且Caspase-12相关通路在LF中上调[2]。Smad2和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)可通过调节上皮间充质转化和细胞外机制的降解参与LF的发生和发展[3]。茵陈蒿汤是一种历史悠久的中医方剂，具有清热，利湿，退黄之功效，有研究认为茵陈蒿汤具有治疗LF的作用，但是关于其机制尚不明确[4]。因此本文主要分析茵陈蒿汤对LF大鼠的治疗作用，并分析其对Caspase-12通路、TIMP-1、Smad2的影响，分析其可能的治疗机制，为临床更好地治疗LF提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，体质量180～210 g，购自河北医科大学动物实验中心，动物生产合格证编号：1703371。苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色试剂盒购自武汉华美公司(中国)。GRP78、eIF2α和Caspase-12一抗以及相关二抗购自Abcam公司(美国)。PVDF膜(Bio-Rad，美国)。PCR引物由Genewiz(苏州，中国)设计和合成。逆转录试剂盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa(日本)。

1.2 建模和药物处理方法

SD大鼠45只随机分为3组，各15只，即对照组，模型组，茵陈蒿汤组。模型组和茵陈蒿汤组通过白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃结合小剂量CCl4腹腔注射建立，CCl4溶解在橄榄油中，体积比为1∶1，注射剂量为0.2 mL/kg体质量，每周2次，连续8周。建模同时使用茵陈蒿汤灌胃，每次10 mL，连续灌胃8周。通过HE染色和Masson染色分析建模情况以及茵陈蒿汤干预效果，血生化检测大鼠肝功能(ALT和AST水平)验证造模的成功性。

茵陈蒿汤制备方法：茵陈18 g，栀子12 g以及大黄6 g制成水煎剂，减压浓缩至0.35 g/mL。大鼠茵陈蒿汤使用剂量通过《中药药理研究方法学》换算为3.5 g /kg。

1.3 检测指标和方法

1.3.1HE染色和Masson染色:大鼠麻醉处死后取出肝脏组织，立即使用4%甲醛溶液在室温下固定24 h。脱水并包埋在石蜡中。将样品切成5 μm厚的均匀薄片并置于APES涂覆的载玻片上。分别通过HE和Masson试剂进行染色，显微镜观察肝组织形态和纤维化程度。

1.3.2Western Blot:使用Western Blot检测肝组织中GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白水平。在液氮的保护下裂解组织细胞，在12 000 r/min，4 ℃下离心15 min收集上清液，使用BCA方法确定蛋白质浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳，电泳后使用PVDF膜进行转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。加入一抗室温震荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗。使用GAPDH作为内参。

1.3.3RT-qPCR:RT-qPCR用于检测肝组织中胶原蛋白Collagen I和Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA的表达水平。将组织在液氮保护下研磨裂解，然后用Trizol法提取组织总RNA并溶解于DEPC水中。使用逆转录试剂盒合成cDNA，反应条件为37℃ 15 min，逆转录酶失活条件为85 ℃ 15 s。用实时PCR试剂盒进行RT-qPCR实验， 95℃ 5 min下激活DNA聚合酶，然后进行40个循环的两步PCR(95℃ 10 s和60℃ 30 s)，延伸75 ℃ 10 min，最终保持在4°C。使用2-ΔΔCT法分析mRNA表达。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

8周后对照组大鼠精力充沛、皮毛光滑。模型组大鼠反应迟钝，皮毛出现明显脱落，并且腹部出现隆起，部分出现出血。干预组大鼠未出现腹部隆起和出血情况，皮毛较完整光滑，精力较充沛。

2.2 各组大鼠肝组织HE染色和血生化结果比较

对照组大鼠的肝组织中细胞大小均一，形态完整，细胞以中央静脉为中心成放射状排列，肝小叶结构完整、清晰。模型组干细胞出现显著形变，细胞排列异常，出现假肝小叶，并且出现炎症反应。茵陈蒿汤组肝组织损伤程度较模型组显著缓解，炎症反应较轻，细胞排列基本紧密。这提示模型组肝组织出现显著的损伤，茵陈蒿汤可显著缓解肝损伤。见图1。血生化结果显示，模型组ALT和AST水平显著高于对照组(P<0.05)，菌陈蒿汤干预后ALT和AST水平显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 各组大鼠8周后肝组织HE染色结果比较Fig.1 Compariso n of HE staining results of liver tissue in the rats of each group after 8 weeks

图2 各组大鼠8周后血ALT和AST水平比较注：与对照组比较，##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01Fig.2 Comparison of serum ALT and AST levels of the rats in each group after 8 weeksNote:compared with the control group ##P<0.01;compared with the model group **P<0.01

2.3 各组肝组织Masson染色结果比较

对各组大鼠肝组织进行Masson染色，图3中灰蓝色为纤维组织，结果显示对照组大鼠肝组织未发现明显的纤维化现象，而模型组肝组织出现大量的纤维化染色，茵陈蒿汤组肝组织基本正常，并且仅有少量的纤维化染色。这提示大鼠LF模型建立成功，茵陈蒿汤可显著抑制LF。

2.4 各组Caspase-12通路比较

建模后8周模型组大鼠肝组织中GRP78、eIF2α和Caspase-12显著升高(P<0.01)，茵陈蒿汤组的GRP78、eIF2α和Caspase-12显著低于模型组(P<0.01)，见表1和图4。

表1 各组GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表达水平比较Table 1 Comparison of GRP78, eIF2α and Caspase-12 protein expression levels in each group

2.5 各组Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA水平比较

模型组的Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA和蛋白水平显著高于对照组(P<0.01)，茵陈蒿汤组Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA和蛋白水平显著低于模型组(P<0.01)，见表2和图5。

图3 各组大鼠8周后肝组织Masson染色结果比较注：与对照组比较，**P<0.01;与模型组比较,# P<0.01Fig.3 Comparison of Masson staining results of liver tissue in the rats of each group after 8 weeksNote:compared with the control group **P<0.01;compared with the model group # P<0.01

表2 各组Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2 mRNA水平比较Table 2 Comparison of mRNA levels of Collagen I, Collagen III, TIMP-1, and Smad2 in each group

图4 各组GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表达水平比较Fig.4 Comparison of GRP78, eIF2α and Caspase-12 protein expression leves in each group

图5 各组Collagen I、Collagen III、TIMP-1、Smad2蛋白水平比较Fig.5 Comparison of protein levels of Collagen I, Collagen III, TIMP-1 and Smad2 in each group

3 讨论

LF是肝脏对反复损伤的伤口愈合反应的结果，多种药物引起的肝损伤会引起LF，此外，慢性病毒性肝炎、酒精毒性、自身免疫性疾病和遗传性代谢紊乱也会引起LF，肝星状细胞(HSC)会发展成肌成纤维细胞样表型，并过量表达平滑肌肌动蛋白和Collagen I、Collagen III蛋白[5]。LF会影响肝功能和机体的代谢水平，并且LF尚无特异性的治疗药物，探究有效的治疗LF的方法具有重要意义。

中药在治疗LF中有着较好的效果，茵陈蒿汤记载于《伤寒论》，具有保肝利胆之功效，有研究显示茵陈蒿汤在治疗肝损伤中有较好的效果[6]，最近也有研究显示茵陈具有治疗LF的作用[7]。本次研究中通过CCl4建立LF模型，并通过HE染色后和Masson染色鉴定建模成功，通过茵陈蒿汤灌胃治疗可显著地减少纤维组织的生成，并保护肝细胞及肝小叶结构，具有较好的保肝作用，这与过往的研究结果相一致[7]。此外，进一步的研究也显示模型组的Collagen I、Collagen III mRNA水平显著高于对照组，茵陈蒿汤组Collagen I、Collagen IIImRNA水平显著低于模型组。基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)可以通过调节基质金属蛋白酶(MMPs)的活性参与细胞外基质的降解[8]。本次研究结果显示模型组的TIMP-1 mRNA水平显著高于对照组，茵陈蒿汤组TIMP-1 mRNA水平显著低于模型组。这说明茵陈蒿汤可抑制细胞外机制的生成，抑制纤维化进程，并保护肝组织，但是关于其治疗机制尚无定论。

有研究认为肝细胞凋亡水平增加是LF过程造成肝损伤的主要因素，细胞凋亡主要有三种通路，即线粒体途径、死亡受体相关通路和内质网应激相关通路，Caspase-12通路可激活内质网应激途径引起细胞凋亡，Caspase-12通路的激活被发现可能是LF的机制之一[9]。本次研究结果显示模型组ALT和AST水平显著高于对照组，菌陈蒿汤干预后ALT和AST水平显著低于模型组，差异具有统计学意义。该结果表明，菌陈蒿汤可以有效改善模型大鼠的肝功能，符合我们的预期。进一步研究结果显示，模型组大鼠肝组织中GRP78、eIF2α和Caspase-12显著升高，茵陈蒿汤组的GRP78、eIF2α和Caspase-12显著低于模型组。研究认为抑制Caspase-12通路可显著减少内质网应激途径减少细胞凋亡[10]。Kim等[11]研究也发现使用caspase抑制剂可以通过调节胶质细胞逆转LF。Smad2可调节上皮间充质转化作用，研究已经发现Smad2是参与LF的发生和发展的重要基因[12]。本次研究结果显示模型组的Smad2 mRNA水平显著高于对照组，茵陈蒿汤组Smad2 mRNA水平显著低于模型组。有研究发现更低水平的TIMP-1具有更好的治疗效果[13]。也有研究发现抑制Smad2可有效地抑制LF[14]。这提示茵陈蒿汤可能通过抑制Caspse-12通路以及Smad2基因的表达抑制肝细胞凋亡和抑制LF，从而发挥保护肝组织的作用。

综上所述，茵陈蒿汤可显著缓解大鼠肝组织的纤维化，这可能由于茵陈蒿汤具有抑制Caspase-12通路以及Smad2基因的表达发挥抗纤维化和抗凋亡的作用有关。说明茵陈蒿汤对于LF具有较好的治疗效果，但是关于其治疗LF的剂量、安全性以及机制还需要进一步研究。