徐雯洁，王鑫，穆方方，李沂晓，刘晓丽，张海军①

(1.淮北师范大学 生命科学学院,安徽 淮北235000；2.淮北市公安局 刑侦支队刑事科学技术研究所DNA室,安徽 淮北235000)

0 引言

乳腺癌是近年来全球范围内女性中发病率和病死率不断上升的恶性疾病之一，尽管可以通过化疗和放疗减少乳腺癌带来的危害，但其仍对女性造成极大伤害，且治疗后复发率极高［1］. 随着中国人口基数增大，生活压力不断提高，以及不规律的生活方式，中国女性中的乳腺癌发病率呈持续上升趋势［2］. 乳腺癌是一种由多种原因引起、极其复杂的疾病，目前已有针对乳腺癌的诊断和治疗方法，但传统治疗方法收效缓慢且对人体有很大伤害，因此，人们希望通过基因治疗找出新的解决方法［3］.

MYBL2 基因又称B-MYB，是转录因子MYB 家族成员. MYBL2 基因位于20q13.1，整个基因包含14个外显子. 已知MYBL2基因的表达水平变化与细胞的增殖分化、细胞凋亡有关［4-6］；该基因与多种癌症密切相关，在宫颈癌［7-8］、肝癌［9］、神经母细胞瘤［10］、前列腺癌［11］、胃癌［12］等癌组织中表达量上调，但MYBL2基因突变在乳腺癌中的研究较少.

高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting，HRM），是近年来新兴的一种主要用于检测体细胞突变潜力的方法，该方法以传统PCR实时荧光定量技术为基础，通过检测DNA双链的解链温度变化来检测DNA 序列的改变［13］. 因其操作简便、耗时短、成本低、常规实验室可完成，目前已得到广泛应用［14-17］. 结合在线分析工具（NCBI）对MYBL2基因中的突变热点区域进行预测，本文拟采用HRM法分析该基因第599位（在外显子5）、第1 472位（在外显子8）、第2 065位（在外显子13）、第2 280位（在外显子14）位点突变，以期解析乳腺癌的发生与MYBL2基因突变的相关性，为进一步阐明乳腺癌发生机制、建立针对乳腺癌新的诊断和治疗方法提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 材料

从新疆某医院获得原发性乳腺癌的冷冻组织标本37 例，且具有完整的病例材料，已经过病理学确诊.

1.2 基因组DNA的提取

采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物公司）对样本组织进行DNA提取，DNA浓度及纯度利用超微量分光光度计测定.

1.3 引物设计及检测

根据GenBank上MYBL2基因的SNP序列得到mRNA上第599位（在外显子5）、第1 472位（在外显子8）、第2 065位（在外显子13）、第2 280位（在外显子14）等位点序列，利用引物设计软件Primer Premier设计特异性引物，引物序列见表1. 引物由上海生工生物公司合成.

表1 HRM分析引物序列

通过常规PCR扩增体系检测引物扩增效率及特异性. 体系如下（10 μL）：DNA模板（0.5 μL）、ddH2O（5 μL）、Forward引物（0.4 μL）、Reverse引物（0.4 μL）、2×Taq PCR Master Mix（5 μL）. PCR扩增程序为：预变性95 ℃，2 min；变性95 ℃，10 s，退火55 ℃，20 s，延伸72 ℃，30 s；40 个循环，最后72 ℃延伸10 min.PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测.

1.4 HRM法分析MYBL2

优化后的HRM-PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环.HRM-PCR 反应体系（10 μL）：RNase-Free ddH2O（6.5 μL）、2×HRM Analysis Premix（5 μL）、10 μM Forward引物（0.3 μL）、10 μM Reverse引物（0.3 μL）、DNA模板（0.5 μL）. 利用Lightscanner进行HRM检测与分析.

1.5 测序验证

为进一步说明MYBL2基因的突变情况，根据HRM分析结果，选择不同突变类型的样品以及正常的癌旁组织样品，进行测序验证.

2 结果

2.1 基因组浓度和纯度测定

对提取的基因组进行浓度和纯度的检测得到提取的基因组DNA，其A260/A280 都在1.8～2.0 之间，完全可以满足HRM分析要求.

2.2 引物扩增特异性检测

设计合成的针对MYBL2 基因不同突变位点的引物通过常规PCR进行抽样检测，结果见图1，各引物扩增效果和特异性均很好，可用于HRM分析.

图1 MYBL2基因外显子PCR电泳图

2.3 高分辨率熔解曲线分析法结果及测序结果

通过高分辨率熔解曲线对待测的37例乳腺癌组织样品进行分析，根据分析结果分别选择突变样本和癌旁组织进行测序.

MYBL2 基因5 号外显子的高分辨率熔解曲线图未发生突变（图2），测序结果显示5 号外显子第599位核苷酸基因型为TT（图5a），结果一致. 在MYBL2 基因中13 号外显子2 065 位（图3）与14 号外显子2 280位（图4）的高分辨率熔解曲线图均未发生突变，核苷酸基因型均为CC（图5b和图5c）未发生基因突变，结果一致. 则5、13、14号外显子不是其热点突变位置，与乳腺癌的发生可能没有关系.

图2 MYBL2基因5号外显子的高分辨率熔解曲线

图3 MYBL2基因13号外显子的高分辨率熔解曲线

图4 MYBL基因14号外显子的高分辨率熔解曲线

图5 MYBL2基因测序结果对比图

MYBL2基因8号外显子的熔解曲线与差分曲线图如图6所示，测序对比结果显示外显子8上第1 472位核苷酸基因由A突变为G（图7），导致编码氨基酸由S突变为G，与HRM结果一致，发生一种突变，则外显子8是MYBL2的热点突变区，乳腺癌的发生可能与其突变有一定的关系.

图6 MYBL2基因8号外显子的高分辨率溶解曲线

图7 MYBL2基因测序结果对比图

3 讨论

乳腺癌是一种女性常见的恶性肿瘤，近年来患病人群年龄逐渐年轻化，发现时间偏晚，错失诊断良机［18］. 随着分子技术的发展，基因突变检测方法愈加多样与准确，TaqMan 探针法、分子信标（Molecular Beacon）、动态等位基因特异性杂交（DASH）［19］、寡核苷酸连接分析（OLA）［20］、测序法（Sequencing）等［21］，但操作复杂、成本较高，无法推广. HRM可以大量快速地筛查样本，灵敏度和特异度高，是一种有效检测单核苷酸突变的方法［22］.

有研究结果表明，MYBL2基因的表达水平在多种癌症组织中显著高于正常组织［7-12］，但其基因突变在乳腺癌中的报道较少，推测MYBL2基因突变可能与乳腺癌的发生有关. 本试验运用HRM分析系统对MYBL2基因的4个外显子进行突变情况分析，以探究该基因与乳腺癌发生的相关性，结果显示MYBL2基因第8号外显子1 472位处发生A→G突变，37例样品中发生12例突变，突变率为32%，在其他外显子上未发现突变. HRM法能有效快速地检测出基因突变，其结果与测序结果一致，在一定程度证明MYBL2基因突变与乳腺癌的发生可能有关，但仍需进行大量重复比对试验进行验证. 本文研究结果将为针对乳腺癌发生和发展相关基因的研究及针对乳腺癌新的临床诊断和治疗方法的研发提供新思路.