黄金智，谢贤聪，张玲莉，谭晓瑜，张 颖* （.广东医科大学附属医院妇产科，广东湛江5400；.广东医科大学，广东湛江 5403）

目前腹腔镜技术在外科手术中运用越来越广泛。因腹腔镜术常需建立CO2气腹通道，而气腹可能造成腹部膨胀，导致腹压上升，某些恶性肿瘤经腹腔镜术后，由于高压力的CO2气腹有可能引发恶性肿瘤的种植转移[1-2]。为研究Beclin1表达增高在CO2气腹中是否能够促进卵巢癌细胞株SKOV3的增殖、迁移，分析其是否存在伴随CO2气腹时间延长而提升肿瘤细胞转移的风险，本课题以卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象，模拟CO2气腹环境，探索促进卵巢癌细胞增值转移能力的分子机制，为腹腔镜临床应用安全性的评估提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 实验仪器 模块化培养室和流量计购自比卢普斯罗森堡公司；CO2气罐和减压阀购自湛江氧气厂。

1.1.2 实验试剂 人卵巢癌细胞株SKOV3购自上海典藏细胞库；过表达质粒、空质粒、干扰表达质粒及阴性对照质粒购于上海吉玛公司； Beclin1和GAPDH引物由上海生工生物技术有限公司合成；兔抗人Beclin1多克隆抗体、抗兔单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Abcam公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；Transwell小室购自康宁公司； WST-1试剂盒购自碧云天公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 人工模拟CO2气腹的建立 采用模块化孵育箱及其CO2气罐模拟CO2气腹环境，进气压力恒定，对SKOV3细胞株作用3 h。CO2作用期间将模块化孵育箱置于细胞培养箱中，尽量与临床腹腔镜环境接近，建立人卵巢癌SKOV3细胞株CO2气腹模型。

1.2.2 实验分组 采用脂质体介导的瞬时转染法，分为Beclin1过表达组、对应的GV362空质粒组、Beclin1干扰表达组、对应的pGPH1空质粒组、单纯脂质体组(空白对照组)，处理时CO2压力相同，作用时间相同。

1.2.3 qRT-PCR实验 5组细胞分别提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，进行实时荧光定量。

1.2.4 Western blot实验 5组细胞分别提取总蛋白，BCA(Bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度，制备上样蛋白，免疫印迹以观察各组蛋白的表达情况。

1.2.5 超氧化物歧化酶法(WST-1)检测细胞增殖 细胞铺板，建立模拟气腹环境，按照试剂盒说明书配置 WST-1 溶液。除上述 5组，另设立空白孔(即无细胞孔，孔内加入同量的培养基)，将各处理组置于细胞培养箱内培养24 h后，经CO2气腹模型处理3 h，继续于细胞培养箱培养 24 h，然后每孔加入10 μL WST-1溶液，在细胞培养箱内继续培养2 h，用酶标仪检测492 nm 处的吸光度，分析细胞增殖情况。

1.2.6 Transwell细胞迁移实验 细胞铺板，建立模拟气腹环境，5组细胞置于细胞培养箱内培养，转染质粒，步骤同上。造模后，消化细胞，在Transwell小室的上室接种1×105个细胞，下室内加入500 μL含有2%胎牛血清的 RPMI1640 培养液，培养2 h，建立CO2气腹，然后进行固定、染色，显微镜高倍镜下观察细胞迁移情况并计数，对比各组迁移细胞数的差异。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 5进行数据分析。计量资料采用±s表示，多个样本之间的比较，满足方差齐性的条件下采用单因素方差分析及LSD检验，不满足方差齐性的条件下采用单因素方差分析及Dunnett T 3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效果

转染24 h后观察荧光表达，随机5个高倍镜荧光表达如图1，转染效率为40%～50%，转染成功。

图1 转染24 h后荧光表达 (×400)

2.2 Beclin1的mRNA表达情况

RT-PCR检测Beclin1的mRNA表达情况，由图2可知：与脂质体空白对照组和空质粒(转染各自的空载体质粒GV362和pGPH1)组相比，转染Beclin1过表达质粒组的Beclin1 mRNA表达明显增高，而转染Beclin1干扰表达质粒组的Beclin1 mRNA表达则明显受到抑制，差异均有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 Beclin1蛋白表达情况

Western blot检测Beclin1的表达情况，由图3、4可知，Beclin1过表达组与脂质体空白对照组和GV362空质粒组比较，Beclin1蛋白表达明显增高；Beclin1干扰表达组与脂质体空白对照组和pGPH1空质粒组比较，Beclin1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 WST-1细胞增殖结果

WST-1细胞增殖结果如图5所示，Beclin1过表达组与脂质体空白对照组和GV362空质粒组比较，细胞增值率明显增高；Beclin1干扰表达组与脂质体空白对照组和pGPH1空质粒组比较，细胞增殖率则明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与空质粒组差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 Beclin1的蛋白表达情况

2.5 Tanswell细胞迁移

Tanswell小室迁移结果如图6、7所示，Beclin1过表达组与脂质体空白对照组和GV362空质粒组比较，迁移入下室的细胞明显增多；Beclin1干扰表达组与脂质体空白对照组和pGPH1空质粒组比较，迁移入下室的细胞明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与空质粒组差异无统计学意义(P>0.05)。

图4 各组Beclin1蛋白相对表达量的比较

图5 各组细胞增殖率的比较

图6 各组细胞结晶紫染色在高倍显微镜下的结果(×200)

图7 各组细胞迁移数的比较

3 讨论

目前腹腔镜技术已运用于多种普通腹部外科疾病的诊治。但近年来研究发现某些恶性肿瘤经腹腔镜术后，容易出现穿刺孔或腹腔内转移[1-2]，其在治疗恶性肿瘤中的应用，医学界出现一些异议。因为腹腔镜术中通常需建立CO2气腹通道，而气腹可能造成腹部膨胀，导致腹压上升。相关研究表明高压力CO2气腹产生的机械性压迫和CO2吸收所致的不利影响表现在呼吸、循环、消化、神经内分泌和炎性应激等多个方面[3-6]。其中最令人关注的是高压力的CO2气腹有可能引发恶性肿瘤的种植转移。CO2气腹促进肿瘤生长和扩散, 主要反映在CO2气腹会增加创口肿瘤细胞的沾染机会，其酸性环境有利于肿瘤细胞的生长，易引起腹膜、内脏缺血，影响机体免疫力，导致肿瘤扩散。CO2气腹不仅可以影响腹膜及细胞微环境，甚至对肿瘤细胞基因及相关因子产生影响，最终引起肿瘤细胞增殖及侵袭能力的改变。

Beclin1是重要的自噬相关基因，本课题在CO2处理下，发现上调Beclin1基因的过表达，SKOV3发生了增殖转移，而抑制Beclin1基因的表达后，SKOV3细胞的增殖转移明显降低，这提示CO2气腹可能通过上调Beclin1基因的表达，进而诱导自噬的发生，增强了人卵巢癌细胞株SKOV3的活力以及抵御不良环境的能力，从而使细胞增殖及迁移能力增强，促进了卵巢癌的生长和转移。有研究证实，饥饿状态下的卵巢癌SKOV3细胞能迅速诱导自噬的发生，而在使用自噬抑制剂或干扰Beclin1表达后，卵巢癌细胞的活力降低，细胞的生长增殖能力被抑制[7]。Beclin1促进卵巢癌细胞株 SKOV3的增殖转移可能是因为CO2制造的缺氧饥饿环境，但其发挥作用的具体机制还不明确。

早期部分学者认为CO2气腹有促进恶性肿瘤增殖的作用。然而近年来，许多学者的研究却得出了相反的结论，即CO2气腹环境对肿瘤细胞的生长增殖有抑制作用。Cai等[8]在体外研究还发现, 湿润的CO2可以用来治疗和预防结肠癌腹腔种植。因此，CO2气腹对肿瘤细胞种植和增殖转移的影响不能一概而论，还需要不断深入研究。