梁春娜，罗志文，郑晔辉，陈志煌 （.广东省开平市中心医院，广东开平 59300；.广州市中医医院，广东广州 5030；3.中国人民解放军南部战区总医院，广东广州 50000）

糖尿病肾病是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一[1-2]，在世界范围内，糖尿病肾病已成为导致终末期肾衰竭的主要原因之一[3]。已有研究表明，在糖尿病肾病的发生发展过程中，高血糖可通过激活TGF-β1/Samd通路，导致细胞外间质的沉积，进而介导肾脏纤维化[4]，使患者肾功能进一步下降，最终走向肾衰竭[5-6]，就目前而言，仍未有良好的防治手段。青蒿素是我国中医药学工作者从草本植物黄花蒿中提取的活性成分，有良好的抗疟和广谱抗寄生虫的作用，同时还具有调节机体免疫、抗炎症、抗纤维化的作用[7-9]；亦有研究证明青蒿素类药物对肾脏有保护作用，但具体机制仍需进一步探讨[10]。本研究通过观察双氢青蒿素对糖尿病肾病大鼠肾功能的保护作用及其对肾脏纤维化的影响，探究其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级8周龄雄性SD大鼠60只，体质量200～220 g，购自广东省医学实验动物中心。

1.1.2 主要实验药物与试剂 链脲佐菌素(STZ) ：美国Sigma公司；双氢青蒿素：南京广润生物制品有限公司；大鼠尿微量白蛋白ELISA试剂盒：南京建成生物科技有限公司；大鼠血肌酐ELISA试剂盒：南京建成生物科技有限公司；大鼠血尿素氮ELISA试剂盒：南京建成生物科技有限公司；蛋白酶磷酸酶抑制剂：上海碧云天生物技术有限公司；组织蛋白提取试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白浓度试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；彩色预染蛋白Marker：武汉博士德生物工程有限公司；蛋白封闭缓冲液：上海碧云天生物技术有限公司；兔抗大鼠TGF-β1抗体、兔抗大鼠E-Cadherin抗体、兔抗大鼠Samd 3抗体、兔抗大鼠P-Samd 3抗体：美国CST公司；兔抗大鼠Fibronectin抗体：美国Millipore公司；兔抗大鼠GAPDH抗体：武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔荧光二抗：美国Invitrogen公司。

1.1.3 主要实验仪器 电子天平：德国Sartorius公司；超低温冰箱(－80℃)：美国Thermo公司；低温离心机：美国Thermo公司；垂直电泳仪、转膜仪：美国Bio-Rad公司；多功能全自动酶标仪：美国Thermo公司；凝胶成像和化学发光图像分析仪：美国Odyssey公司。

1.2 构建动物模型

从60只正常SPF级雄性SD大鼠中随机抽取10只作为正常对照组，剩余50只使用腹腔注射链脲佐菌素的方法构建糖尿病大鼠模型。具体方法为：禁食12 h后一次性腹腔注射链脲佐菌素55 μg/g(体质量)。1周后，取大鼠尾静脉血液，通过血糖仪测定血糖，连续3次随机血糖＞16.7 mmol /L 并且有多饮多食多尿大鼠选定为糖尿病模型。糖尿病造模成功后，继续饲养4周，检测尿微量白蛋白≥30 mg /L即为糖尿病肾病模型。50只大鼠中，有47只造模成功。

1.3 方法

将成功建模的糖尿病肾病大鼠(n=47)随机分为模型对照组(n=11)、低剂量组(n=12)、中剂量组(n=12)、高剂量组(n=12)。低、中、高剂量组分别给予双氢青蒿素10、20、40 g/(kg·d)灌胃。模型对照组给予等体积生理盐水灌胃。所有组均治疗8周。

1.4 观察指标

治疗前各组大鼠禁食12 h，测体质量、24 h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮。分别于双氢青蒿素治疗2、4、8周后，各组大鼠禁食12 h，测体质量、24 h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮。8周末处死大鼠，提取其肾脏皮质中的蛋白质用于Western-blot检测TGF-β1、 Samd 3、 P-Samd 3、 Fibronectin及 ECadherin相关蛋白的表达情况。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

在双氢青蒿素治疗8周后，糖尿病肾病模型大鼠最终存活41只，其中模型对照组10只，低剂量组11只，中剂量组10只，高剂量组10只。最终纳入统计分析的共有大鼠51只。

2.1 双氢青蒿素对大鼠体质量的影响

使用双氢青蒿素治疗后，低、中、高剂量组大鼠体质量低于正常对照组，但相较于模型对照组大鼠的体质量明显回升(P<0.05)。不同剂量治疗组间大鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.2 双氢青蒿素对大鼠24 h尿微量白蛋白的影响

使用双氢青蒿素治疗后，低剂量组大鼠24 h尿微量白蛋白与模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而中、高剂量组在治疗4、8周后24 h尿微量白蛋白下降(P<0.05)。详见表2。

表1 双氢青蒿素对大鼠体质量的影响 (±s，g)

表1 双氢青蒿素对大鼠体质量的影响 (±s，g)

与正常对照组比较：a P<0.05；与模型对照组比较：bP<0.05

images/BZ_32_226_445_1155_515.png正常对照组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 11 10 10 441.1±52.2460.3±42.7487.1±35.5 353.2±31.8a 335.4±32.1a 313.2±34.9a 411.7±52.6b 427.1±38.7b 433.7±51.5ab 408.1±58.1ab 412.8±42.6ab 428.2±54.3ab 415.6±62.3b 429.1±53.2b 432.2±48.1ab

2.3 双氢青蒿素对大鼠肾功能的影响

使用双氢青蒿素治疗后，低、中、高剂量组大鼠的血肌酐、尿素氮较模型组明显下降，高剂量组血肌酐、尿素氮下降更为显著，但仍明显高于正常对照组(P<0.05)。详见表3。

表2 双氢青蒿素对大鼠24h尿微量白蛋白的影响(±s，mg/L)

表2 双氢青蒿素对大鼠24h尿微量白蛋白的影响(±s，mg/L)

与正常对照组比较：a P<0.05；与模型对照组比较：bP<0.05

images/BZ_32_227_1436_1157_1507.png正常对照组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 11 10 10 7.3±5.76.9±4.38.1±5.6 103.2±21.8a 131.1±28.4a 113.5±20.2a 101.5±22.3a 118.4±29.7a 108.3±21.1a 98.2±23.8a 78.0±11.9ab 71.5±10.7ab 100.3±24.7a 79.1±10.4ab 74.2±11.4ab

2.4 双氢青蒿素对大鼠肾脏中蛋白表达的影响

在双氢青蒿素治疗8周后，模型对照组大鼠肾脏中的TGF-β1、Samd 3、P-Samd 3、Fibronectin蛋白表达明显高于正常对照组，而E-Cadherin表达则明显降低(P<0.05)。低、中、高剂量组与模型对照组比较，Fibronectin和TGF-β1表达下降，E-Cadherin则明显上升；中、高剂量组的Samd 3表达亦明显降低，且其磷酸化水平明显低于模型对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

3 讨论

随着生活水平的提高，我国糖尿病的患病率在逐年上升[11]。糖尿病肾病是糖尿病最重要的血管慢性并发症之一，在我国，约有30%～40%的糖尿病患者伴发有糖尿病肾病[12]。其主要病理变化最初为肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜细胞增生，系膜基质增多，进而出现纤维蛋白原沿基膜沉着，最终进展为肾小球硬化，宏观上表现为肾脏的纤维化[13]，截自目前为止，未能找到针对性较强的治疗方法[14]，其预后主要取决于疾病的早诊断与早治疗[15]。

TGF-β是一个有着多种功能的生长因子超家族，在多种组织与器官中可促进纤维化[17]。TGF-β1的下游存在众多信号通路，其中Samds通路在调控TGF-β1介导的上皮细胞向肌成纤维细胞的转化及细胞外基质积聚过程中处于十分重要的地位[18]。其中，Samd 3属受体调节型Samds，它的磷酸化是Samd通路激活的最重要的标志之一。细胞内pSamd 3表达的多少即意味着该通路激活的程度[19]。在糖尿病肾病的发生发展过程中，TGF-β1/Samd通路发挥着重要的作用[20]。但是否能通过药物调控该通路抑制糖尿病肾病的病情进展，目前仍未有定论。

青蒿素是中药青蒿的提取物，因其对疟疾的治疗而广为人知[21]。已有研究证实，青蒿素及其衍生物除了抗疟疾外，还有免疫调节、抗炎症、抗纤维化的作用[22]。目前研究已证实青蒿素及其衍生物可在心脏、肝脏、肺脏、肾脏等多器官纤维化进程中发挥作用[23-25]。其衍生物SM934可用于治疗小鼠狼疮性肾炎[26]。在大鼠实验性膜性肾病的研究中，SM934通过下调TGF-β1/ Samd信号通路改善大鼠肾脏损伤，减轻肾小管间质纤维化[10]。双氢青蒿素为青蒿素的衍生物之一，其可明显延缓肝脏及肺脏的纤维化，发挥相应的保护作用[28]。但其在肾脏中的作用尚不明确。故而，本研究旨在探讨双氢青蒿素在糖尿病肾病中可能发挥的的作用及其机制。

在本研究中，我们将健康的SD大鼠随机分成正常对照组、模型对照组，及低、中、高剂量组。双氢青蒿素治疗后，大鼠的体质量回升，尿微量白蛋白减少，血肌酐及尿素氮明显下降(P<0.05)，提示双氢青蒿素具有一定的肾脏保护作用，且其保护作用的强弱可能与双氢青蒿素的给药剂量有关。为进一步探讨其可能的机制，治疗8周后，我们处死大鼠，取其肾脏组织并提取其中的蛋白用于检测，发现纤维化相关蛋白Fibronectin在治疗后的表达明显降低，同时，作用于上皮细胞间相互连接的蛋白E-cadherin的表达量明显回升至正常水平(P<0.05)，证明双氢青蒿素治疗的大鼠，其肾脏纤维化水平降低甚至可能得到逆转。在对其作用靶点的探索中发现，加入双氢青蒿素干预后，TGF-β1/Samd通路蛋白的表达发生了改变，主要表现为TGF-β1表达明显下降，且与双氢青蒿素剂量有关；同时，P-Samd 3表达亦明显下降，提示该信号通路的活化得以抑制；且中、高剂量组的Samd 3表达亦受到影响，提示双氢青蒿素可能影响了Samd通路蛋白的合成。此次研究结果表明，双氢青蒿素可能通过抑制TGF-β1的表达，降低Samd通路蛋白的磷酸化，甚至可能同时抑制Samd通路蛋白的合成调节肾脏纤维化的进程。

表3 双氢青蒿素对大鼠血肌酐、尿素氮的影响 (±s)

表3 双氢青蒿素对大鼠血肌酐、尿素氮的影响 (±s)

与正常对照组比较：a P<0.05；与模型对照组比较：bP<0.05

images/BZ_32_207_2728_2273_2862.png正常对照组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 11 10 10 30.3±5.230.9±4.330.1±5.66.1±1.26.2±1.06.1±1.0 79.1±9.1a 80.2±9.7a 79.9±8.6a 13.3±1.3a 13.6±1.2a 13.4±1.6a 77.5±11.3a 78.5±10.3a 77.5±11.3a 13.5±1.1a 12.9±1.4a 13.1±1.5a 76.2±13.8a 73.2±9.9a 71.2±10.1ab 12.2±1.8a 12.1±1.6a 12.0±1.1ab 73.3±9.7a 71.7±8.7ab 70.2±10.2ab 9.8±1.3ab 9.6±1.5ab 9.5±1.6ab

图1 不同剂量双氢青蒿素对大鼠肾脏中蛋白表达的影响

综上所述，双氢青蒿素可能通过TGF-β1/Samd通路抑制肾脏纤维化的进程，对肾脏有一定的保护作用，可改善糖尿病肾病大鼠的一般情况，为糖尿病肾病的药物治疗提供了新的理论和实践依据。